Development and use of contactless magnetic manipulation methodologies for the formation of 3D cardiac models

Abstract

Bu tezde, manyetik levitasyon ve manyetik biyo-kalıplandırmaya dayalı iki yeni yöntem geliştirilmiştir. Her iki tekniğin optimizasyon basamakları NIH/3T3 hücreleri ile gerçekleştirilmiştir. Optimizasyon aşamasından sonra H9c2 rat kardiyomiyosit hücreleri kullanılarak 3 boyutlu (3B) kardiyak modeller oluşturulmuştur. Manyetik levitasyon tekniği ile başlangıç hücre sayısı, gadobutrol konsantrasyonu ve kültür süresi degiştirilerek boyutları ayarlanabilir 3B sferoidler elde edilmiştir. Biyo-kalıplandırma yönteminde ise aljinat, manyetik nanopartikül ve hücre içeren biyomürekkep formülasyonu geliştirilmiştir. Ardindan, 3B hücresel yapılar disk, halka ve dikdörtgen şeklinde elde edilmistir. Karakterizasyon aşamasında ise kolajen I, F-aktin ve DAPI immun boyama ile başarılı bir şekilde analiz edildi. Ayrıca bunlara ek olarak kardiyak troponin T ve MYH6 kardiyak spesifik belirteçleri gösterildi. Son olarak, 3B kardiyak modellerin ilaç yanıtlarının değerlendirilmesi için doksorubusin uygulanmıştır. Manyetik levitasyon ve manyetik biyo-kalıplandırma yöntemleri ile elde edilen 3B kardiyak modeller için IC50 değerleri sırasıyla 14.7 μM ve 8.1 μM olarak elde edilmiştir. Standard 2B hücre kültürü için ise IC50 degeri 3.5 μM olarak hesaplanmıştır. 3B kardiyak modeller 2B kontrol grubu ile karşılaştırıldığında ilaç uygulamasına daha çok direnç göstermektedir. Tezin son aşamasinda, 3B kardiyak yapılar birlikte kültürlenen WTC kardiyomiyosit ve kardiyak fibroblast hücreleri kullanılarak biyokalıplandırma yöntemi ile elde edilmiştir. Kardiyak yapının karakterizasyonu ise α-aktinin, kolajen-I, Cx-43, Troponin T, and DAPI immun boyama yöntemi ile gerçekleştirilip başarılı bir şekilde gözlenmiştir. Bu sonuçlar göz önüne alındığında manyetik levitasyon ve manyetik biyo-kalıplandırma yöntemi ile oluşturulan 3B kardiyak modellerin birçok doku mühendisliği uygulamaları özellikle ilaç tarama çalışmaları için geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında iyi bir alternatif olabilecektir.

In this thesis, two contactless magnetic manipulation methodologies were introduced, which are magnetic levitation (MagLev) and biopatterning techniques. The optimization steps of both techniques were completed with NIH/3T3 mouse fibroblast cells. Later, 3D cardiac models were developed using H9c2 rat cardiomyocytes. For the MagLev technique, tunable 3D spheroids were obtained with changing initial cell seeding number, gadobutrol concentrations, and culturing time. For the biopatterning approach, a new bio-ink formulation, which comprises alginate, magnetic nanoparticles, and cells, was developed. Further, biopatterned cellular structures were fabricated in different shapes such as discs, rings, and rectangles under an external magnetic field. Later, characterization was done successfully via immunostaining of collagen I, F-actin, and DAPI. Moreover, cardiac-specific markers; cardiac troponin T and MYH6 were analyzed for both 3D cardiac spheroids and patterned 3D cardiac structures. Finally, doxorubicin was applied to evaluate the drug responses. IC50 values were calculated as 14.7 μM and 8.1 μM for 3D cardiac spheroids and 3D cellular structures respectively, while standard 2D cell culture was 3.5 μM which indicated 3D cardiac models were more resistant to drug exposure. In the last part of thesis, patterned 3D cardiac structures were fabricated using co-cultured hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac fibroblast cells via biopatterning methodology. Characterization was carried out successfully by immunostaining of α-actinin, collagen I, Cx-43, Troponin T, and DAPI. Taken together, to fabricate 3D cell culture models, MagLev and biopatterning-based contactless manipulation methodologies may be good alternatives to conventional 2D cell culture methods for tissue engineering applications, especially for drug screening.