Cloning, expression, and in silico analyses of selected xth enzymes from different plant species

Abstract

Bitki hücre duvarı, bitkinin yaşam döngüsü boyunca hücre duvarı polisakkaritlerini modifiye edebilen enzimler tarafından gerçekleştirilen değişikliklere ve adaptasyonlara uğramaktadır. Ksiloglukan adındaki önemli ve bol miktarda bulunan selülozik olmayan β-bağlı bir polisakkarit, bitki hücre duvarında yük taşıyan yapılar oluşturmak için selüloz mikrofibrillerini bağlar. Bitki hücre duvarındaki modifikasyonlar, önemli bir modifiye edici enzim olan ksiloglukan endotransglikosilaz/hidrolazlar (XTH'ler) tarafından gerçekleştirilir, ve XTH genleri amino asit sekanslarındaki benzerliklere göre (Grup I, II, III-A, III-B, IV ve EG16) altı gruba ayrılmıştır. Karbonhidrat matrisini değiştiren bu enzimlerin rollerini anlamak, verimi artırmak ve bitkiyi dış etkenlerden korumak için hücre duvarı özelliklerini modifiye etmek için gereklidir.XTH'nin farklı bitki türlerdineki çalışma mekanizmalarını aydınlatmak ve bitkiler ile polisakkarit substratları arasındaki ilişkileri aydınlatmak için, yeterince aydınlatılmamış bir alt grup olan Grup III-B'ye ait AtXTH30 genini ve enzimatik karakterizasyonu henüz yapılmamış EtXTH1 genini seçtik. Bu tezin amacı, A. thaliana ve Equisetum XTH enzimlerini moleküler, transkriptomik ve protein seviyelerinde araştırmak ve bu enzimlerin nasıl çalıştığını ve hangi işlevleri yerine getirdiğini daha iyi anlamaktır. EtXTH1 ve AtXTH30 enzimleri, bu çalışma süresince heterolog ekspresyon ile üretilemedi. Ancak Arabidopsis thaliana ve Equisetum ailesi üyelerinden E. telmateia, E. hymale ve E. diffusum'un XTH genleri transkriptom analizleri ile tanımlanmıştır. Filogenetik ve transkriptom analizleri, XTH genlerinin katalitik motiflerinin korunduğunu ve belirli durumlarda, amino asit ikameleri ile türden türe değişiklik göstererek spesifik XTH genlerinin enzimatik aktivitesini etkilediğini ortaya çıkardı. Yüksek oranda korunmuş protein motifleri belirlendi ve AtXTH30 protein yapısı modellendi. Ayrıca, oluşturulan filogenetik ağaç, geniş ölçüde transferaz/hidrolaz aktivitesine sahip olabilen XTH enzimleri arasındaki ilişki hakkında bilgi sağlayabilmektedir.

During the plant life cycle, the plant cell wall undergoes alterations and adaptations which are accomplished by enzymes able to modify cell wall polysaccharides. A significant and abundant non-cellulosic β-linked polysaccharide called xyloglucan binds cellulose microfibrils to create supporting structures in cell wall of the plant. Modifications in the plant cell wall are carried out by a crucial modifying enzyme xyloglucan endotransglycosylase/hydrolases (XTHs), and is divided into six groups (Group I, II, III-A, III-B, IV and EG16) depending on the similarities of their amino acid sequences. Understanding the roles of these enzymes that change the carbohydrate matrix is essential for altering cell wall characteristics to increase yield and preserve the plant from external factors. In order to shed light on the working process of XTH in different species and elucidate the relationships between the plants and their polysaccharides substrates, we were selected the AtXTH30, Arabidopsis thaliana XTH gene ,which belongs to a poorly studied sub-clade Group III-B; and EtXTH1, Equisetum telmateia XTH gene, which has not been enzymatically characterized. The objective of this thesis was to investigate A. thaliana and Equisetum XTH enzymes at the molecular, transcriptomic, and protein levels to gain a better insight of how these enzymes work and what functions they serve. Equisetum telmateia. EtXTH1 and AtXTH30 enzymes could not be heterologously expressed during the period of this study. However, XTH genes of Arabidopsis thaliana, Equisetum family members Equisetum telmateia, Equisetum hymale and Equisetum diffusum were identified by transcriptome analyses. Phylogenetic and transcriptome analyses revealed that catalytic motifs of XTH genes were maintained and, in certain circumstances, varied from species to species by amino acid substitutions, influencing the enzymatic activity of specific XTH genes. Highly conserved protein motifs were determined and AtXTH30 protein structure was modelled. Moreover, generated phylogenetic tree provide information about the relationship between the XTH enzymes that could be broadly capable of transferase/hydrolase activity.