Pichia pastoris'te kendinden indüklenebilir bir heterolog protein ekspresyon sisteminin geliştirilmesi

Abstract

Amaç: Bu çalışmada, rekombinant protein üretiminde sıklıkla kullanılan Pichia pastoris'te metanol ile indüklenebilir alkol oksidaz (AOX) promotörü kontrolünde kültür ortamına metanol ilave etmeden, kendinden indüklenebilir bir ekspresyon sisteminin geliştirilmesi amaçlandı.Yöntem: Kodon optimize yeşil floresan protein (GFP) geni, pPICZαB vektörüne klonlandı. Elde edilen pPICZαB-GFP, P. pastoris X-33 genomuna ve genomunda pGKBα-PME taşıyan P. pastoris (pGKBα-PME/X-33) genomuna entegre edildi. Ayrıca pPICZαA-Azu da pGKBα-PME/X-33 hücrelerinin genomuna entegre edildi. Elde edilen maya transformantları, YPD-zeosin agar plaklarına transfer edilerek yüksek dozda antibiyotiğe dayanıklı transformantlar seçildi. pPICZαB-GFP/X-33 hücrelerinin %0,5 metanol indüksiyonu ile GFP ekspresyonunu belirlemede floresan spektrofotometre ve SDS-PAGE analizi kullanıldı. Kendinden indüklenebilir sistemin geliştirilmesi için pGKBα-PME+pPICZαB-GFP/X-33 hücreleri, farklı konsantrasyonlarda pektin içeren besiyerinde üretime alındı. Üretim ortamındaki hücrelerde AOX protein ekspresyonunu belirlemek için western blot analizi yapıldı. Kültür ortamında metanol varlığını belirlemede GC-MS analizi kullanıldı. Farklı inkübasyon süreleri sonunda toplanan kültür sıvılarında GFP ekspresyonunu belirlemede floresan spektrofotometre ve SDS-PAGE analizi kullanıldı. Diğer yandan, pGKBα-PME+pPICZαA-Azu/X-33 hücreleri pektin içeren üretim besiyerinde inkübasyona bırakıldı. Farklı inkübasyon süreleri sonunda toplanan kültür sıvılarında azurin proteinin ekspresyonunu belirlemek için western blot analizi yapıldı.Bulgular: Metanol indüksiyonu ile pPICZαB-GFP/X-33 hücreleri tarafından en iyi ekstrasellüler GFP üretimi, 120 saatlik inkübasyon sonunda gerçekleştirildi. Farklı miktarlarda pektin içeren, metanol ilave edilmeyen kültür ortamlarında pGKBα-PME+pPICZαB-GFP/X-33 hücrelerinde AOX protein ekpresyonu gözlendi. Aynı zamanda kültür ortamlarında metanol varlığı tespit edildi. Farklı inkübasyon süreleri sonunda P. pastoris ikili promotör sistemi tarafından ekstrasellüler GFP üretiminin gerçekleştirildiği görüldü. Diğer yandan, pektin içeren üretim besiyerinde pGKBα-PME+pPICZαA-Azu/X-33 hücrelerinin azurin proteinini ürettiği gözlendi.Sonuçlar: Bu tez çalışmasında pektin içeren, metanol ilave edilmeyen ortamda rekombinant P. pastoris hücreleri tarafından hem GFP hem de azurin proteininin üretimi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Böylelikle, literatürde ilk defa Pichia pastoris'te kendinden indüklenebilir bir heterolog protein ekspresyon sistemi geliştirilmiştir.Anahtar Kelimeler: P. pastoris, Heterolog protein, İndüksiyon, Pektin, GFP, Azurin

Purpose: In this study, it was aimed to develop a self-inducible expression system without adding methanol to the culture medium under the control of methanol-inducible alcohol oxidase (AOX) promoter in Pichia pastoris, which is frequently used in recombinant protein production.Method: The codon optimized green fluorescent protein (GFP) gene was cloned into the pPICZαB vector. The resulting pPICZαB-GFP was integrated into the P. pastoris X-33 genome and the P. pastoris (pGKBα-PME/X-33) genome carrying pGKBα-PME. In addition, pPICZαA-Azu was also integrated into the genome of pGKBα-PME/X-33 cells. Obtained yeast transformants were transferred to YPD-zeocin agar plates and high dose antibiotic resistant transformants were selected. Fluorescent spectrophotometer and SDS-PAGE analysis were used to determine GFP expression by 0.5% methanol induction of pPICZαB-GFP/X-33 cells. To improve the self-inducible system, pGKBα-PME+pPICZαB-GFP/X-33 cells were grown in medium containing pectin at different concentrations. Western blot analysis was performed to determine AOX protein expression in cells in the production medium. GC-MS analysis was used to determine the presence of methanol in the culture medium. Fluorescent spectrophotometer and SDS-PAGE analysis were used to determine GFP expression in collected culture broths at the end of different incubation times. On the other hand, pGKBα-PME+pPICZαA-Azu/X-33 cells were incubated in production medium containing pectin. Western blot analysis was performed to determine the expression of azurin protein in collected culture broths at the end of different incubation timesFindings: The best extracellular GFP production by pPICZαB-GFP/X-33 cells with methanol induction was achieved after 120 hours of incubation. AOX protein expression was observed in pGKBα-PME+pPICZαB-GFP/X-33 cells in culture media containing different amounts of pectin without methanol addition. At the same time, the presence of methanol was detected in the culture media. At the end of different incubation times, extracellular GFP production was observed by the P. pastoris dual promoter system. On the other hand, it was observed that pGKBα-PME+pPICZαA-Azu/X-33 cells produced azurin protein in production medium containing pectin.Results: In this thesis study, both GFP and azurin protein were successfully produced by recombinant P. pastoris cells in a pectin-containing medium without methanol addition. Thus, a self-inducible heterologous protein expression system was developed in Pichia pastoris for the first time in the literature.Keywords: P. pastoris, Heterologous protein, Induction, Pectin, GFP, Azurin