The identification of the mechanisms of LRBA deficiency dependent defects in regulatory T-cell function

Abstract

Primer immün yetersizlik (PİY) sendromları tekrar eden enfeksyonlara neden olan hastalık grubudur. lipopolysaccharide-responsive beige like anchor protein (LRBA) proteinini kodlayan gendeki foksiyon kaybı mutasyonlarının otoimünite ile ilişkilendirilmiş PİY sendromlarına neden olduğu belirlenmiştir. LRBA molekülünün CTLA-4 proteininin hücre yüzeyindeki ifadesini kontrol ettiği belirlenmiştir. CTLA-4 proteini yanında LRBA proteininin epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve FasL proteinlerinin hücre yüzeyinde ifade edilmesini kontrol ettiği bilinmektedir.Bu çalışmanın ana hedefi T lenfositlerde LRBA eksikliğinin yol açtığı bozukluların keşfidir. Bu amaç ile Jurkat T lenfosit lösemi hücre hattı model olarak kullanılmış ve CRISPR/Cas9 sistemi aracılığı ile LRBA proteini bu hücrelerden silinmiştir. Mutant ve yabanıl tip Jurkat hücrelerinin yüzeyde ifade ettiği proteinlerdeki değişiklikler yüzey biyotinilasyonu ve kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. LRBA ifade etmeyen hücrelerin yüzeylerinde CD3, CD4, PVRIG, NOTCH3, CD1d, ve Sema7A proteinlerinin azaldığı ve CD53, CD148, CD154, CD134, A33, ve CD70 proteinlerinin de arttığı belirlenmiştir. LRBA kaybında CD3 ve CD4 proteinlerinin azalması en önemli fark olarak ortaya çıkmaktadır. Beklenildiği gibi endojen CTLA-4 proteininin yüze ifadesi de mutant hücrelerde azalmaktadır. Ek olarak CTLA-4 proteininin mutant hücrelerde yüksek seviyede eksojen olarak ifadesi, CTLA-4 yüzey seviyelerini yabanıl tip hücrelerdeki seviyeye ulaştıramadığı da gözlemlenmiştir. Bu bulgu LRBA kaybının dominan bir fenotip olduğunu göstermektedir. Bu çalışma LRBA proteininin alternatif hedeflerini keşfetmiş ve CTLA-4 yüzey ifadesinin mekanizmasını ortaya çıkarmıştır. Yeni LRBA hedeflerinin bulunması bağışıklık sistemi bozukluğu hastalıklarının teşhis ve tedavisinde kullanılabilecektir.

Primary immunodeficiencies are a very diverse group of disorders characterized by recurring infections. Loss of function mutations in the gene encoding LRBA (lipopolysaccharide-responsive beige like anchor protein) were recently identified to cause PID which is associated with autoimmunity. Several studies have shown that the LRBA molecule regulates CTLA-4 cell surface expression. Besides CTLA-4, LRBA has been claimed to have an effect on the vesicular trafficking of epidermal growth factor receptor (EGFR) and cell surface expression of FasL in the plasma membrane. In this study, the main objective was to discover the defects caused by LRBA deficiency in T-cells. For this purpose, the Jurkat leukemic T-cell line was used as the model cell line and the CRISPR/Cas9 system was used to knock-out (KO) this protein in the Jurkat cell line. The differentially expressed proteins on the surface of WT and KO Jurkat cells were assessed by the means of cell surface biotinylation coupled with mass spectrophotometry (MS) analysis. CD3, CD4, PVRIG, NOTCH3, CD1d, and Sema7A were found to be downregulated and CD53, CD148, CD154, CD134, A33, and CD70 to be upregulated in LRBA negative cell lines. We identify the decrease in CD3 and CD4 seemed to be most significant and relevant to the loss of LRBA. As expected, endogenous CTLA-4 expression was also decreased in our LRBA KO cell lines. Additionally, CTLA-4 protein overexpression could not rescue CTLA4 expression to WT levels in LRBA KO Jurkat cell lines indicating the dominant phenotype obtained by LRBA loss. This study identifies alternative targets of the LRBA protein and delineates the mechanism of surface CTLA4 expression, potentially identifying new targets that can be used to cure immunodeficiencies resulting from LRBA loss.