Fenolik madde tayini için lakkaz temelli amperometrik bir biyosensör geliştirilmesi ve gıda analizinde kullanımı

Abstract

Gıdaların karakterizasyonunda ve insan sağlığına olası etkilerinin ortaya çıkarılmasında fenolik bileşik içeriklerinin belirlenmesi büyük önem taşımaktadır. Gıdalarda fenolik bileşik analizi için geleneksel teknikler maliyetlidir ve zaman alan numune hazırlama adımları gerektirir. Günümüzde biyosensörler, bu tür geleneksel tekniklere alternatif olarak fenolik bileşikler için güvenilir, uygun maliyetli, pratik ve yerinde analizlere olanak sağlamaktadır. Bu tezde, toplam fenolik bileşik tayini için basit ve kullanımı kolay bir lakkaz temelli amperometrik biyosensör geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla Trametes versicolor ticari lakkazı, tutuklama yöntemiyle jelatine immobilize edildi. Karbon pasta elektrot, immobilize enzimin grafit tozu ve mineral yağ ile homojenize edilmesiyle hazırlanmıştır. Üçlü elektrot sistemi ile yapılan amperometrik ölçümlerde standart fenolik bileşik olarak gallik asit kullanılmıştır. Lakkaz temelli biyosensörün çalışma koşulları ve immobilizasyon koşulları gibi deneysel değişkenler optimize edildi. Optimum immobilizasyon koşullarına göre hazırlanan biyosensörün karakterizasyonu ve gerçek numunelerin toplam fenolik içeriklerinin belirlenmesinde kullanılabilirliği araştırıldı. Deneysel sonuçlara göre lakkaz temelli biyosensör için reaksiyon koşulları, 50 mM derişimli fosfat tamponu (pH 6,0) ve 40ºC; biyosensörün biyoaktif tabakası için immobilize edilen enzim miktarı 1,25 U/5,0 μL; jelatin miktarı 2,0 mg olarak optimize edildi. Geliştirilen biyosensörün karakterizasyon çalışmaları sonucunda, gallik asit için doğrusal tayin aralığı 0,5-100 μM, cevap süresi 50-100 saniye ve tayin sınırı (LOD) 0,1323 μM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik çalışmalarında (n=10) 20 μM gallik asit ortalama değer (x̄), standart sapma (±S.S.) ve varyasyon katsayısı (% V.K.), 20,83544 ±0,774916 μM ve % 3,7 olarak hesaplandı. Oda koşullarında depolanan biyosensör, 10 günün sonunda immobilize enzim aktivitesinin % 86'sını korumuştur. Geleneksel yöntemlerle elde edilen üzüm fermente içeceklerden hardaliye ve şarap örneklerinde toplam fenolik madde tayini için geliştirilen biyosensörün performansı değerlendirilmiştir. Eşdeğer gallik asit miktarına göre biyosensör tarafından ölçülen toplam fenolik madde miktarı, likid kromatografi-kütle/kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) yönteminden elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır. Ayrıca hardaliye ve şarabın içeriğinde bulunan bazı maddelerin biyosensör cevabına girişim etkileri araştırılmıştır. Lakkaz temelli biyosensör sonuçları, LC-MS/MS kullanılarak yapılan analiz sonuçlarıyla karşılaştırıldığında, hardaliye ve şarap için sırasıyla % 100,44 ve % 97,2 korelasyon gösterdiği hesaplanmıştır.

The determination of phenolic compound contents is of the great importance to characterizing foods and finding out the potential human health effects. Traditional techniques for phenolic compound analysis in foods are costly and require time-consuming sample preparation steps. Nowadays, the biosensors, as an alternative to such conventional techniques, enable to reliable, cost-effective, practical and on-site analyses for phenolic compounds. In this thesis, the development of a simple and easy-to-handle laccase based amperometric biosensor for the determination of total phenolic compound was aimed. For this purpose, commercial Trametes versicolor laccase was immobilized to gelatin by the entrapment method. Carbon paste electrode was prepared by homogenized of immobilized enzyme with graphite powder and mineral oil. Gallic acid was used as the standard phenolic compound for the amperometric measurements performed with the triple electrode system. Experimental variables such as operating conditions and immobilization conditions of the laccase based biosensor were optimized. The characterization of the biosensor prepared according to the optimum immobilization conditions and its utility for the determination of total phenolic contents of real samples were investigated. According to the experimental results, the reaction conditions for the laccase based biosensor were 50 mM of phosphate buffer (pH 6.0) and 40ºC; for the bioactive layer of the biosensor, the amounts of immobilized enzyme and gelatin were optimized as 1.25 U/5.0 μL and as 2.0 mg, respectively. As a result of the characterization studies of the developed biosensor, the linear detection range for gallic acid was determined as 0.5-100 μM, the response time as 50-100 seconds and the detection limit (LOD) as 0.1323 μM. In the reproducibility studies (n=10), the mean value (x̄), standard deviation (±S.S.) and coefficient of variation (%V.K.) at 20 μM gallic acid concentration were calculated as 20.83544 ±0.774916 μM and, 3.7% respectively. The biosensor storaged at room conditions maintained 86% of the immobilized enzyme activity at the end of the 10 days. The performance of the developed biosensor was evaluated for the determination of total phenolic compounds in hardaliye and wine samples which are grape fermented beverages obtained by traditional methods. The total amount of phenolic substance measured by the biosensor according to the equivalent amount of gallic acid were compared with the results obtained from the liquid chromatography-mass/mass spectrometry (LC-MS/MS) method. In addition, the interference effects of some substances in the content of hardaliye and wine on the biosensor response were investigated. The results of laccase based biosensor correlated that 100.44% and 97.2% for hardaliye and wine, respectively, compared with the results of the analysis using LC-MS/MS.