Pulpa kaynaklı kök hücrelerin biyomateryal ve dentin üzerine tutunmasına konsantre büyüme faktörünün etkisi

Abstract

Bu çalışmanın amacı insan molar dişlerinin pulpasından kök hücreleri izole etmek ve bu hücrelerin MTA, Biodentine ve dentin üzerinde tutunmasına ve farklılaşmasına konsantre büyüme faktörünün (CGF) etkisini immunohistokimyasal, kolorimetrik ve mikroskobik tekniklerle değerlendirmektir.Pulpa kök hücreleri, insan 3. molar dişlerin pulpasından elde edildi. Aseptik şartlarda izole edilen pulpa dokusu parçalara ayrılarak alfa-MEM ortamda 40 gün kültüre edildi. Farklılaştırılmamış hücreler stoklanarak kök hücre bankası oluşturuldu ve deneylerde pasajlanarak kullanıldı Hücrelerin kök hücre karakterizasyonu CD90, CD105, CD73, CD44, CD19, CD45 ve CD34, CD11b, CD14, CD19, CD79α ve HLA-DR yüzey antijenleri ile kit kullanılarak flow sitometri ile analiz edildi. Kültürlenen hücreler kontrol amaçlı osteosit ve adipositlere farklılaştırıldı. Deneylerde kullanmak üzere kök parçalarını oluşturmak için insan üst santral dişlerinin, kök kanalları standart şekilde genişletildi ve vertikal olarak 2 simetrik parçaya ayrılarak boyları 6 mm olacak şekilde kesildi. Çalışmada; 1. Grup sadece dentin, 2.grup sadece pulpa kök hücreleri, 3.grup sadece MTA, 4.grup sadece Biodentine, 5.grup Dentin +MTA, 6. Grup Dentin + Biodentine, ve 1. 2. 5. ve 6. Grupların CGF eklenmiş haliyle toplam 10 adet deney grubu oluşturuldu. Biodentine veya MTA kullanılan gruplarda, biyomateryal kanal oluklarının yarı uzunluğuna (3mm) uygulandı, geri kalan dentin kısmı açıkta bırakıldı. CGF gönüllü hastalardan kan alınarak elde edildi ve taze olarak örneklerin üzerine yerleştirildi. Daha sonra örneklerin üzerine pulpa kök hücreleri ekilerek, hücre kültür kabında inkübe edildi. Örneklere 14 ve 21 gün sonra MTT ve ALP aktivite testi uygulandı. Kalsiyum iyonlarının belirlenmesi için örnekler Alizarin Red S ile boyandı. Örnekler taramalı elektron mikroskobunda (SEM) incelenerek, fotoğraflandı.CGF kullanılan gruplarda, CGF'siz gruplara göre anlamlı olarak daha fazla hücre tutundu ve çoğaldı. MTA içeren gruplar kontrol grubuna göre daha az hücre sayısı gösterirken, Biodentine içeren grupta kontrol grubuna göre anlamlı olarak daha fazla sayıda hücre gözlendi. ALP aktivitesi, tüm gruplarda kontrol grubuna göre daha yüksek bulundu. Bu bulgu Alizarin Red S boyaması ile de desteklendi. SEM incelemelerinde, CGF kullanılan gruplarda hücrelerin sayısının ve tutunmasının anlamlı olarak daha iyi olduğu gözlendi.

The aim of this study was to describe in vitro isolation of dental pulp stem cells from human molar teeth and evaluation of the effect of concentrate growth factor (CGF) on adhesion and proliferation of pulp-derived stem cells to biomaterials and dentin by immunohistochemistry, colorimetric assay and Scanning electron microscopy.Dental pulps were obtained from sound human third molars extracted for therapeutic reasons. Extracted pulp tissue was minced into small pieces. The tissue blocks were cultured in the alpha modification of Eagle medium (Gibco-BRL, Grand Island, NY) supplemented with 20% fetal bovine serum and a complex of 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL streptomycin.Dental pulp stem cells (DPSCs) characterized by flow cytometric analysis of CD90, CD105, CD73, CD44, CD19, CD45 ve CD34, CD11b, CD14, CD19, CD79α ve HLA-DR. To control stem cell nature, cultured cells differentiated into osteocytes and adipocytes. Pulp derived stem cells were pooled to establish stem cell bank. To obtain root canal fragments, single root teeth were collected. After separation of the crowns at cemento-enamel junction, roots were instrumented and vertically divided into two pieces. Samples divided into 10 groups and were set up as follows; group 1: only dentin, group 2: only pulp stem cells, group 3: only MTA, group 4: only Biodentinee, group 5: MTA+ Dentin, group 6: Biodentine + dentin and group 1, 2, 5 and 6 with CGF.Biomaterials were placed into half-length of canals. CGF were obtained from volunteers and freshly placed on root canal fragments Then stem cells were seeded into samples with culture medium. After 14 and 21 days, MTT and ALP Activity test was performed. The samples were stained with Alizarin Red S to evaluate calcium ions. Finally, samples were then examined using a scanning electron microscope at various magnifications. While the groups with MTA demonstrated the lower number of cells, the groups with Biodentine demonstrated the significantly higher number of cells. CGF significantly increased the number of cells and their adhesion. The ALP activity was higher in the presence of dentin that was also demonstrated on alizarin red s staining.