Hibrit çizgili levrek kaynaklı WB Piscidin 5 ve modifiye WB Piscidin 5 peptidlerinin Pichia pastoris ekspresyon sisteminde rekombinant üretimi

Abstract

Antimikrobiyal peptidler (AMP'ler), prokaryotlardan insanlara kadar çok çeşitli yaşam formları tarafından doğal olarak üretilen ve mikroorganizmalar üzerinde inhibitör etkisi bulunan bileşiklerdir. Bu tez çalışmasında gıda, tarım ve hayvancılık vb. alanlarda antimikrobiyal koruyucu olarak kullanılabilecek rekombinant antimikrobiyal peptidlerin üretimi amaçlanmıştır. Bu amaçla gen kaynağı olarak deniz kaynaklı hibrit çizgili levreğe (Morone chrysops x Morone saxatilis) ait bir peptid olan WB Piscidin 5 (WB Pis5) seçilmiştir. Ayrıca WB Pis5 peptidinin dizisi modifiye edilerek modifiye WB Piscidin 5 (MWB Pis5) peptidi tasarlanmıştır. Bu iki peptidin rekombinant yöntemle Pichia pastoris (Komagataella phaffi) ekspresyon sisteminde üretilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla ilk olarak WB Pis5 ve MWB Pis5 peptidlerini kodlayan nükleotid dizileri rekürsif PCR tekniği ile elde edilmiştir. Elde edilen hedef DNA dizileri hem klonlama hem de ekspresyon vektörü olan pPICZA'ya bağlandıktan sonra Escherichia coli DH5α hücrelerinde klonlanmış ve daha sonra P. pastoris GS115 hücrelerine transforme edilmiştir. Rekombinant AMP'lerin, P. pastoris hücreleri tarafından üretimi, %1'lik metanol indüksiyonu ile çalkalamalı kültür ortamında 96 saat süreyle gerçekleştirilmiştir.Kültür ortamından saflaştırılan rekombinant WB Pis5 ve MWB Pis5 peptidlerinin konsantrasyonları sırasıyla 579 μg/L ve 895 μg/L olarak belirlenmiştir. Üretim sonrasında besiyeri ortamından izole edilip saflaştırılan rekombinant peptidlerin antimikrobiyal etkileri Gram-negatif bakteriler olan E. coli O157:H7 (ATCC 43894), E. coli (ATCC 25922), Enterobacter cloacae (ATCC 13047), Enterobacter sakazakii (Klinik izolat), Pseudomonas aeruginosa (Klinik İzolat), Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) ve Gram-pozitif bakteriler olan Bacillus cereus (ATCC 33019), Bacillus cereus (ATCC 11778), Listeria monocytogenes (ATTC 7644), Metisilin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) (ATTC 43300), Staphylococcus aureus (ATCC 25293), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) üzerinde test edilmiştir. Agar difüzyon yönteminde test edilen bakterilerin tamamı için inhibisyon zonu oluşumu gözlenmiştir. Minimum inhibisyon konsantrasyonlarının (MİK) ise rWB Pis5 için 2-8 ng/ml ve rMWB Pis5 için 1-8 ng/ml arasında değiştiği tespit edilmiştir.Sonuç olarak, tez çalışması kapsamında rekombinant peptidlerin başarılı bir şekilde üretimi gerçekleştirilmiş, modifiye peptidin (rMWB Pis5) doğal peptide (rWB Pis5) göre antimikrobiyal aktivite yönünden daha başarılı sonuçlar verdiği tespit edilmiştir. Bu nedenle tez çalışması kapsamında üretilen peptidlerin gıda, tıp, hayvancılık ve veterinerlik alanlarında kullanılma potansiyelinin yüksek olduğu ancak ticari bir ürüne dönüştürülmesi için daha ileri çalışmalara ihtiyaç olduğu sonucuna varılmıştır.Anahtar Kelimeler: Antimikrobiyal peptid, AMP, Rekombinant AMP, WB Piscidin 5 (WB Pis5), Modifiye WB Piscidin 5 (MWB Pis5)

Antimicrobial peptides (AMPs) are compounds that are naturally produced in a wide variety of life forms, from prokaryotes to humans, and have an inhibitory effect on microorganisms. In this thesis, it is aimed to produce recombinant antimicrobial peptides that can be used as antimicrobial preservatives in the fields of food, agriculture and animal husbandry. For this purpose, WB Piscidin 5 (WB Pis5), a peptide of marine hybrid striped bass (Morone chrysops x Morone saxatilis), was chosen as the gene source. In addition, modified WB Piscidin 5 (MWB Pis5) peptide was designed by modifying the sequence of the WB Pis5 peptide. It is aimed to produce these two peptides by recombinant method in Pichia pastoris (Komagataella phaffi) expression system. For this purpose, firstly, nucleotide sequences encoding WB Pis5 and MWB Pis5 peptides were obtained by recursive PCR technique The resulting target DNA sequences were cloned in Escherichia coli DH5α cells after ligation into both the cloning and expression vector pPICZαA and then transformed into P. pastoris GS115 cells. Production of recombinant AMPs by P. pastoris cells was carried out carried out in shake flasks with 1% methanol induction for 96 hours.The concentrations of recombinant WB Pis5 and MWB Pis5 peptides purified from the culture medium were determined as 579 μg/L and 895 μg/L respectively. The antimicrobial effects of recombinant peptides isolated and purified from the medium after production were tested on Gram-negative bacteria E. coli O157:H7 (ATCC 43894), E. coli (ATCC 25922), Enterobacter cloacae (ATCC 13047), Enterobacter sakazakii (Clinical Isolate), Pseudomonas aeruginosa (Clinical Isolate), Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) and Gram-positive bacteria Bacillus cereus (ATCC 33019), Bacillus cereus (ATCC 11778), Listeria monocytogenes (ATTC 7644), Metisilin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) (ATTC 43300), Staphylococcus aureus (ATCC 25293), Staphylococcus aureus (ATCC 29213). Inhibition zone formation was shown for all bacteria tested in the agar diffusion method. Minimum inhibition concentrations (MIC) were determined between 2-8 ng/ml for WB Pis5 and 1-8 ng/ml for MWB Pis5.As a result, in thethis thesis, recombinant peptides was successfully produced and it was determined that the modified peptide (rMWB Pis5) exhibit higher antimicrobial activity compared to the natural peptide (rWB Pis5). For this reason, it was concluded that the peptides produced within the scope of the thesis study have a high potential to be used in food, medicine, livestock and veterinary fields, but further studies are needed to convert them into a commercial product.Keywords: Antimicrobial peptide, AMP, Recombinant AMP, WB Piscidin 5 (WB Pis5), Modified WB Piscidin 5 (MWB Pis5)