Mezenkimal kök hücre yaşlanmasında NF-KB/P65 ve PKNOX2 protein-protein etkileşimlerinin incelenmesi

Abstract

Mezenkimal kök hücreler in vitro kültürde pasajlamalar sonucu replikatif yaşlanmaya uğrayarak kök hücre özelliklerini kaybeder. Grubumuzun daha önceki çalışmalarında sağlıklı Kİ-MKH'de PKNOX2 proteini ile yapılan ko-immünopresipitasyon (ko-İP) sonrası proteomiks analizlerinde PKNOX2 ile etkileşime giren proteinler arasında yaşlanma ilişkili sekretomların ana düzenleyicisi olarak kabul edilen Nüklear Faktör-κB'nin p65 alt ünitesi (NF-κB/p65) bulunmuştur. Bu tez çalışmasında; 1) kültür ortamında yaşlandırılan Kİ-MKH'lerde PKNOX2 ve p65/RelA protein düzeylerinde değişim olup olmadığının araştırılması, 2) PKNOX2 ve NF-κB/p65 (RelA) etkileşiminin kanıtlanması ve 3) yaşlanma sürecindeki etkileşim değişimlerinin olup olmadığının incelenmesi amaçlanmıştır. Replikatif yaşlanma SA-β-Gal boyaması ve p16, p21 protein seviyeleri ile değerlendirildi. Genomik stres, γH2AX seviyeleri immünofloresans görüntüleme ile tespit edildi. Western blotlama sonuçları, PKNOX2 protein düzeylerinin replikatif yaşlanma ile azalma eğiliminde olduğunu gösterdi. 200 μM H2O2 ile indüklenen oksidatif stresin Kİ-MKH'de genel olarak NF-κB/p65 protein düzeylerini arttırdığını gösterdi. Ko-İP sonrası western blotlama ve in situ proximity ligation assay (PLA) teknikleri ile NF-κB/p65 ve PKNOX2 etkileşimde olduğu in vitro ve in situ tespit edildi. PLA analizleri, NF-κB ve PKNOX2'nin etkileşimlerinin Kİ-MKH'lerinin hem sitoplazma hem de çekirdeğinde mevcut olduğunu gösterdi ve etkileşim düzeylerinin 9. pasajda arttığını ve pasaj 12'de düştüğünü gösterdi.

Mesenchymal stem cells undergo replicative senescence by cultivating in vitro and as the passage extends they lose their stem cell properties. Previous study of our group investigating proteomics of the co-immunoprecipitated proteins with PKNOX2 revealed interacting proteins with PKNOX2 in BM-MSCs. Nuclear factor kappa B (NF-κB) subunit p65, a main regulator of senescence-related secretomes, was among the interacting proteins with PKNOX2. Goals of this thesis were 1) to investigate the changes in PKNOX2 and p65/RelA protein levels of BM-MSCs aged by serial passaging in culture, 2) to demonstrate the interaction of PKNOX2 and NF-κB/p65 (RelA) and 3) to examine interaction changes during the cellular aging process if there are any. Replicative senescence was assessed by SA-β-Gal staining and p16, p21 protein levels determined by Western blot analysis. Genomic stress was assessed by γH2AX levels obtained by immunofluorescence imaging. Analysis of western blotting showed that PKNOX2 protein levels tended to decrease with replicative senescence and NF-κB/p65 protein levels overall increased in BM-MSCs exposed to oxidative stress induced by 200 µM H2O2. NF-κB/p65 and PKNOX2 interactions were detected in vitro using co-IP followed by western blot and in situ using proximity ligation assay (PLA) technique. PLA analyzes showed that interactions of NF-κB and PKNOX2 were present both in the cytoplasm and nucleus of BM-MSCs, and the levels of interaction increased at passage 9 and decreased at passage 12.