Glioblastoma multiforme, menenjiyom (birincil) ve metastaz (ikincil) beyin tümörlerine ait fenotiplerin belirlenmesinde kullanılacak bütünleşik omiks analizler için analitik yöntem geliştirilmesi ve uygulanması

Abstract

Genotip ve fenotip arasındaki doğrudan nedensel ve fonksiyonel bağlantıları göstermek için protein, metabolit ve lipit gibi ara moleküler seviyelerin kapsamlı şeklilde incelenmesi çok önemlidir. Kapsamlı metabolomik ve lipidomik analizler için birden çok analitik tekniğe ve analiz koşullarının optimizasyonuna ihtiyaç vardır. Çalışma kapsamında metabolomik analizler eş zamanlı olarak GC-MS ve LC-qTOF-MS ile lipidomik analizler ise LC-qTOF-MS ile gerçekleştirilmiş ve kullanılan analitik yöntemler çeşitli deneysel tasarımlar ile optimize edilmiştir. Plazma örnekleri için metanol:su:kloroform (3:1:3, h/h/h), doku örnekleri için ise metanol:su:diklorometan (2:1:3, h/h/h) metabolitlerin, lipitlerin ve hatta proteinlerin tüketilmesi için optimum çözücü karışımları olarak belirlenmiştir. Doku örneklerinin GC-MS temelli metabolomik analizleri için sililleme reaktifinin inkübasyon süresi ve sıcaklığının, metoksiamin derişimi-metanol hacmi etkileşiminin, plazma örnekleri içinse metoksiamin derişimi ile sililleme reaktifinin inkübasyon süresinin ve metanol-metoksiamin hacmi etkileşiminin analiz sonuçlarını etkileyen önemli parametreler olduğu belirlenmiştir. LC-qTOF-MS temelli metabolomik analizler için uçurulan örneklerin yeniden çözülmesinde kullanılan hareketli faz bileşiminin hem doku hem de plazma örneklerinden yapılan analizlerin sonuçlarını etkilediği tespit edilmiştir. LC-qTOF-MS temelli metabolomik ve lipidomik analizlerin kromatografik koşullarına etki eden parametreler ise Box-Behnken tasarımı ile optimize edilmiştir. Metabolomik ve lipidomik analizler için geliştirilen analitik yöntemler beyin tümörlü hasta grupları ile kontrol grubunu oluşturan bireylerden toplanan doku ve plazma örneklerine uygulanmış ve bu tümörlere ait fenotipler aydınlatılarak sonuçlar klink açıdan bütüncül olarak değerlendirilmiştir.

A thorough examination of intermediate molecular levels such as protein, metabolite, and lipid is required to establish direct causal and functional links between genotype and phenotype. Comprehensive metabolomics and lipidomics analysis require the optimization of analysis conditions, as well as the use of multiple analytical techniques. In the thesis, metabolomics analyses were performed with GC-MS and LC-qTOF-MS, and lipidomic analyses were carried out with LC-qTOF-MS. The analytical techniques utilized were optimized with several experimental designs. The optimum solvent combinations for the extraction of metabolites, lipids, and even proteins were determined to be methanol:water:chloroform (3:1:3, v/v/v) for plasma samples and methanol:water:dichloromethane (2:1:3, v/v/v) for tissue samples. For GC-MS based metabolomics analyses performed with tissue samples; incubation time and temperature of silylation reagent, methoxyamine concentration-methanol volume interaction, and for plasma samples; methoxyamine concentration, incubation time of silylation reagent and methanol-methoxyamine volume interaction, were found to be important parameters affecting the analysis results. The mobile phase composition used as reconstitution solution for LC-qTOF-MS based metabolomics analyses was determined to have a significant effect on the analysis results. The Box-Behnken design was used to optimize the parameters affecting the chromatographic conditions of LC-qTOF-MS based metabolomics and lipidomics analyses. The developed analytical methods were applied to tissue and plasma samples of patients and control groups. The phenotypes of the tumors were illuminated by comparing them to the control group, and the results were evaluated in a holistic manner from a clinical point of view.