Kedi ve köpek böbrek lezyonlarının patomorfolojik ve immunohistokimyasal yöntemlerle karşılaştırmalı olarak incelenmesi

Abstract

Bu tez çalışmasında, doğal olgulardan elde edilen ve hastalıktan şüpheli köpek ve kedi böbreklerinin patomorfolojik yönden incelenip karşılaşılan bulguların tanım ve tanısı ile kronik olgularda bağ dokusu artışının (fibrozisin) patogenezinin immunohistokimyasal yöntemlerle karşılaştırmalı olarak araştırılması amaçlandı. Bu amaçla, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı'na nekropsi incelemesi için getirilen; üriner sistem ve üriner sistemi etkileyebilecek anamnez veya klinik bilgisine sahip 46 kedi ve 79 köpekten elde edilen toplam 125 hayvana ait böbrekler incelendi. Makroskopik incelemeden sonra alınan doku örnekleri % 10'luk tamponlu formalinde tespit edilip, parafinde bloklandı. Mikrotomla 4 μm kalınlığında alınan doku kesitleri, rutin deparafinizasyon ve rehidrasyon işlemlerini takiben Harris'in hematoksilen-eozin (HE) yöntemiyle boyandı ve ışık mikroskobunda değerlendirildi. Ayrıca gerek görülen doku kesitlerine Masson'un trikrom ve Periyodik Acide Schiff (PAS) özel boya yöntemleri uygulandı. İmmunohistokimyasal incelemede, kronik olgularda (12 köpek, 7 kedi) gelişen fibrozisin patogenezi araştırıldı. Bu bağlamda, özellikle kaynaklarda belirtilen, tubul epitellerinin epitelyal mezenşimal dönüşüm (EMT) ile epitel hücre özelliklerini kaybedip mezenşimal hücre özelliği kazanıp kazanmadığı; TGF-β1, sitokeratin, E kaderin, S100A4, α-SMA, vimentin ve nestin primer antikorları uygulanarak Avidin-Biotin Complex Peroksidase (ABC-P) yöntemiyle değerlendirildi. Antijen retrieval olarak sıcaklık veya tripsin; kromajen olarak 3'3-Diaminobenzidin (DAP) kullanıldı. Endojen biyotin blokajı için yumurta akı ve süt tozundan yararlanıldı. Patomorfolojik incelemede köpeklerin % 33,3'ünde nefritis, % 48,9'unda nefrozis, % 4,4'ünde infarktus, % 2,2'sinde hidronefroz ve % 11,1'inde neoplazi tespit edildi. Kedilerde ise % 51,6 nefritis, % 35,5 nefrozis, % 3,2 infarktüs ve % 9,7 neoplazi belirlendi. Köpeklerde nefrozislerin, kedilerde ise nefritislerin yoğunluk kazandığı ve her iki böbrekte şekillendiği saptandı. Köpeklerde nefritislerin % 13,3'ü akut, % 6,7'si subakut, % 80'i kronik; nefrozislerin % 9,1'i akut, % 27,3'ü subakut ve % 63,6'sı kronikti. Kedilerde bu oranlar nefritislerde % 25 subakut, % 75 kronik; nefrozislerde % 18,2 akut; % 63,6 subakut ve % 18,2'si kronik şeklinde değerlendirildi. Köpeklerde 37 dejeneratif ve yangısal olgunun 29'unda, kedilerde ise 27 olgunun 19'unda hem glomerul hem de tubulointersitisyel bölgeler etkilenmişti. Köpeklerdeki nefrozis olgularının % 36,7'sinde; kedilerde % 18,2'sinde tubul lümenlerinde kristallere rastlandı. Kronik karekterli nefritis ve nefrozislerin köpeklerde % 70,3; kedilerde % 51,9 oranında oluştuğu dikkati çekti.İmmünohistokimyasal incelemede, intersitisyel fibrozis alanlarındaki tubul epitellerinde E kaderin ve sitokeratin pozitifliğinin azaldığı veya kaybolduğu gözlendi. Buna karşılık anılan hücrelerde hafif de olsa vimtentin pozitifliğinin belirmesi; peritubuler ve periglomeruler bölgelerde bağ doku artışıyla beraber α-SMA pozitif miyofibroblastların artması, fibrozisin EMT yoluyla geliştiği görüşünü güçlendirmiştir. Özellikle EMT olgusunda başlatıcı rol üstlenen TGF-β1'in fibrozisin geliştiği bölgelerdeki tubul epitellerinde ve yangı hücrelerinde tespit edilmesi de bu bağlamdaki görüşleri destekleyen önemli bir kanıt sayıldı. Ayrıca daha önce insan, rat ve farelerde de tespit edilip EMT için kanıt olabileceği ileri sürülen S100A4 pozitifliği, ilk kez bu çalışmadaki kedi ve köpek böbreklerinde aynı bölgedeki tubul hücrelerinde bulundu. Kedilerde sitokeratin – EMT ilişkisi de bu çalışmayla ortaya çıkarıldı. Çalışmada köpeklerde ne normal tubul epitellerinde ne de hasarlı tubul epitellerinde herhangi bir nestin pozitifliğine rastlanmazken kedilerde hasarlı glomerullerin pariyetal epitelleri ile dejenere tubul epitel hücrelerinin tamamı pozitifti. Ayrıca, hem köpeklerde hem kedilerde normal glomerul podositlerinin nestin ekspresyonu yönünden pozitif olduğu, ancak glomerul hasarıyla pozitifliğin kaybolduğu gözlendi. Sonuç olarak bu araştırmada; köpeklerde nefrozislerin, kedilerde ise nefritislerin yoğunluk kazandığı dikkati çekti. Bu bulgular aynı bölgede önceden yapılan retrospektif araştırmalar ile kıyaslandığında, her iki türdeki nefritislerin oranında bir miktar azalma; nefrozislerin oranında ise kayda değer bir artış olduğu görüldü. Nefrozis ve nefritis olgularının her iki türün her iki böbreğinde tespit edilmesi, nefritislerin çoğunlukla hematojen enfeksiyondan, nefrozislerin ise dolaşım bozukluğu veya nefrotoksik etkili sistemik hastalıklardan kaynaklanabileceğini düşündürdü. Nefritis ve nefrozis olgularının çoğunda lezyonların hem glomerul hem de tubulointersitisyel bölgelerde yerleşmesi; bölgeler arasındaki yakın ilişkiyi, birindeki değişikliğin diğerini etkileyebileceğini gösterdi. Kronik yangısal ve dejeneratif olguların fazla olması ise böbrek hastalıklarının erken dönemde teşhis edilmesinde yetersiz kalındığını; geç farkına varıldığını yansıtan kaynak bilgilerini doğrular nitelikte bulundu. Bazı farklılıklar olsa da kronik olgularda gelişen fibrozisin patogenezinde yer alan epitelyal mezenşimal transformasyonun köpek ve kediler için de geçerli olduğu immunohistokimyasal bulgularla belirlendi. Bu bağlamda, kediler ve özellikle köpeklerde yapılacak kapsamlı araştırmaların ve antifibrotik tedavi denemelerinin insanlar için de model oluşturacağı kanısına varıldı.

In this thesis study, it was aimed to investigate the pathology of dog and cat kidneys which were obtained from animals with naturally occuring kidney disease or suspected of having a kidney disease (pathology) pathomorphologically; and the pathogenesis of connective tissue increase (fibrosis) in chronic cases comparatively with immunohistochemical methods.For this purpose, a total of 125 animals kidney (46 cats and 89 dogs) which submitted for necropsy examination to Ankara University, Faculty of Veterinary Medicine, Department of Pathology with history or clinical data about a sickness that could affect the urinary system were examined. After the macroscopic examination, the tissue samples were fixed in 10% buffered formalin and embedded in paraffin. Tissue sections taken at 4-μm thickness with microtome were stained with Harris's hematoxylin-eozin (HE) method following routine deparaffinization and rehydration procedures and evaluated with light microscopy. Masson's trichrome and periodic acid Schiff (PAS) staining methods were applied to the required tissue sections.In the immunohistochemical study, the pathogenesis of fibrosis developing in chronic cases (12 dogs and 7 cats) was investigated. In this regard, based on recent studies, whether the tubule epithelium has lost epithelial cell properties and gained mesenchymal cell properties with epithelial-mesenchymal transition (EMT) was investigated with TGF-β1, cytokeratin, E cadherin, S100A4, α-SMA, vimentin and nestin primer antibodies by Avidin-Biotin Complex Peroxidase (ABC-P) method. Heating or trypsin as antigen retriever; 3'3-Diaminobenzidine (DAB) as chromagen were used. Egg whites and powdered milk were used for blocking of endogenous biotin.In the pathomorphological examination, nephritis (33,3%), nephrosis (48,9 %), infarction (4,4%), hydronephrosis (2,2%) and neoplasia (11,1%) were identified in dogs. Nephritis (51,6%), nephrosis (35,5%) , infarction (3,2%) and neoplasia (9,7%) were detected in the cats. While nephrosis were common in dogs, nephritis were more intense in cats. In all these animals, both kidneys were affected. Nephritis cases were classified (distributed) as acute (13,3%), subacute (6,7%), chronic (80%) in dogs and subacute (25%), chronic (75%) in cats. Nephrosis cases were observed as acute (9,1 %), subacute (27,3%) and chronic (63,6%) in dogs; acute (18,2%), subacute ( 63,6%) and chronic ( 18,2 %) in cats. Both glomerular and tubulointerstitial regions were effected in 29 of 37 degenerative and inflammatory cases in dogs and in 19 of 27 degenerative and inflammatory cases in cats. Crystal deposition in the tubular lumen accounts for 36,7% of degenerative kidney cases in dogs and 18,2 % in cats. 70,3 % of nephritis and nephrosis were chronic in dogs; and 51,9% in the cats.Immunohistochemical examination showed that, there was a decrease or loss in E cadherin and cytokeratin tubular expression in areas with interstitiel fibrosis. On the other hand, in the same areas, light expression of vimentin in a small number of tubule cells and strong α-SMA positive myofibroblast accumulation in peritubular and periglomerular fibrotic areas were present. This data support the hypothesis of tubuler epitelial cells has a role in renal fibrosis via EMT. In particular, the detection of TGF-β1 which accepted as an inducer of EMT, in tubule epithelia and inflammatory cells in regions of fibrosis was also considered as evidence supporting this view. In addition, the positivity of S100A4 in tubule cells in the same areas was first found in kidneys of cats and dogs in this study. This positivity of S100A4 in tubule cells which was previously detected in humans, rats and mice claimed to be as evidence for EMT. The cytokeratin - EMT relationship in the cats was also revealed by this study. In the study, no nestin positivity was present neither in the normal tubule epithelium nor damaged tubule epithelium in the dogs, whereas all of the parietal epithelia of the damaged glomeruli and the degenerated tubule epithelial cells were positive. It was also observed that normal glomerular podocytes were positive for nestin expression in dogs and cats, but that positivity disappeared with glomerular injury.In conclusion, in this research; intensity of nephrosis in dogs, and nephritis in cats attracted attention. When compared with preliminary surveys in the same area, these findings show a slight decrease in the proportion of nephritis in both species; a significant increase in the rate of nephrosis was seen. Detection of nephritis or nephrosis in pairs of kidneys suggests that nephritis may be caused by hematogenous infection and nephrosis may be caused by circulatory disorder or nephrotoxic systemic diseases. Both glomerular and tubulointerstitial regions were affected from most lesions of nephritis and nephrosis; this close relationship between the regions showed that a change in one could affect the other region. Excessive chronic inflammatory and degenerative conditions shows that kidney diseases are insufficiently diagnosed at an early stage; the source information reflecting the fact that there was a late recognition. Immunohistochemical findings indicate that the EMT involved in the pathogenesis of fibrosis developing in chronic cases, is also valid for dogs and cats with some differences. In this context, it has been concluded that the extensive investigations and antifibrotic treatment trials of cats and especially dogs would be model study for people.