Rejeneratif tıp uygulamaları için osteokondüktif biyopolimer/bor minerali temelli biyokompozit iskelelerin üretimi ve karakterizasyonu

Abstract

Bu tez çalışmasında, insan saçı keratini ve sıçan kuyruğu kollajeninin eşsiz fizikokimyasal ve biyolojik özellikleri, kemik gelişiminde kritik rol oynayan bor ve silisyum gibi inorganik moleküllerin getirdiği biyoaktif özellikleriyle birleştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, rejeneratif tıp ve KDM uygulamalarında kullanılmak üzere organik/inorganik biyomalzeme olarak, biyoaktif bor ve silika molekülleri sol-jel yöntemiyle kollajen ve keratin proteinlerine modifiye edilmiştir. Sentez sonucunda, osteokondüktif özellikte yeni 3B biyokompozit kriyojeller (B-Si-Col-HK) elde edilmiştir. Kriyojellerin sol-jel yöntemi ile sentezi tamamen oda koşulları altında yapılmıştır. Proteinlerin biyokimyasal karakterizasyonları, Lowry protein, -SH grup, amino asit, hidroksiprolin, SDS-PAGE ve MALDI-TOF analizleriyle yapılmıştır. Sentezlenen kriyojellerin kimyasal ve yapısal özellikleri, organik-inorganik faz arasındaki bağların varlığını doğrulayan ATR-FTIR, 11B-MAS-NMR ve XRD teknikleriyle değerlendirilmiştir. Ayrıca, kriyojellerin termal stabilite ve mekanik mukavemetleri; TGA, DSC, basma testi ve hidrojel formu için reoloji analizleriyle belirlenmiştir. Spesifik yüzey alanları ve gözenekliliklerin belirlenebilmesi için BET, porozite, şişme ve sıvı alım testleri yapılmıştır. İlaveten, kriyojellerin in vitro bozunma davranışı ve yüzey ıslanabilirlik özellikleri, biyobozunurluk testi ve temas açısı ölçümü ile ortaya çıkarılmıştır. Sol-jel reaksiyonu sonucu moleküler içi-arası bor ve silika molekülleriyle bağlı kriyojel yapıların geniş yüzey alanına sahip olduğu belirlenmiştir. Bor ve silika nano-partikülleriyle kaplanmış polimerin yüzey pürüzlülüğü artmış ve kriyojellerin sıvı emilim hızında da artış gözlemlenmiştir. In vitro çalışmalar, kriyojellere iAMKH'lerin ekimiyle yürütülmüş, kriyojellerin biyouyumluluğu live/dead ve MTS testiyle değerlendirilmiştir. Kriyojeller üzerindeki iAMKH'lerin osteojenik farklılaşma düzeyleri, histokimyasal/immünohistokimyasal boyamalar ve qRT-PCR analizi yapılarak belirlenmiştir. Kriyojel yapısındaki inorganik bileşenler tarafından hücrelerin indüklenmesiyle osteojenik farklılaşmanın tespiti gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, qRT-PCR analizinde ise osteogenez ile ilişkili genlerin ekspresyonunun da önemli ölçüde arttığı görülmüştür.

In this thesis study, it is aimed to combine these unique physicochemical and biological properties of human hair keratin and rat tail collagen with the bioactive properties brought by inorganic molecules such as boron and silicon, which play a critical role in bone development. For this purpose, the organic/inorganic biomaterial that can be used in regenerative medicine and BTE applications, collagen and keratin proteins have been modified with bioactive boron and silica molecules by the sol-gel method. As a result of the synthesis, novel three-dimensional (3D) biocomposite cryogels (B-Si-Col-HK) with osteoconductive properties were obtained. The synthesis of cryogels with the sol-gel method was completely performed under room conditions. Biochemical characterizations of proteins were performed by Lowry protein, -SH group, amino acid, hydroxyproline, SDS-PAGE, and MALDI-TOF analyzes. The chemical and structural features of the synthesized cryogels were evaluated by ATR-FTIR, 11B-MAS-NMR, and XRD techniques, which confirmed the presence of bonds between the organic-inorganic phase. In addition, thermal stability and mechanical strength of cryogels; were determined with TGA, DSC, compression test, and the hydrogel form rheology analyses. BET, porosity, swelling, and fluid intake capacity tests were also performed to determine specific surface areas and porosity properties. Additionally, the in vitro degradation behavior and surface wettability properties of cryogels were evaluated by a biodegradability test and contact angle measurement. As a result of the sol-gel reaction, it was determined that the cryogel structures have a large surface area connected with inter-intramolecular boron and silica molecules. The surface roughness of the boron and silica nanoparticles coated polymer surface has increased and also an increase in the liquid absorption rate of cryogels was observed. The in vitro studies were carried out by the cultivation of hADMSCs into cryogels and the biocompatibility of cryogels was evaluated by Live/Dead and MTS tests. Osteogenic differentiation levels of hADMSCs on the cryogels were determined by performing histochemical/immunohistochemical stainings and qRT-PCR analysis. Osteogenic differentiation was observed by the induction of cells from the inorganic components of the cryogels. Moreover, in the qRT-PCR analysis, it was observed that the osteogenesis-related gene expressions were also significantly increased.