Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)'in laboratuvar ortamında üretilmesi ve fetal bovine serum (FBS) için bitkisel alternatiflerlerin geliştirilmesi

Abstract

Memeli hücreleri için geliştirilen kültür ortamlarında karbohidratlar, proteinler, vitaminler, organik tuzlar gibi maddeleri içeren çeşitli besiyerleri kullanılır. Bu besiyerlerinden biri DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) dir. Hücre besiyerlerine ayrıca bileşeni Fetal Sığır Serumu (FBS) ismi verilen önemli bir bileşen eklenir. FBS üretimi, anne ve yavru sığır için ölümle sonuçlanan acılı bir süreci kapsamaktadır ve ekonomik ve lojistik bakımdan sorunlara neden olur. Bu tez çalışmasında, insan hücrelerinin farklı FBS, soya, badem, hindistan cevizi ya da inek sütü içeren DMEM'de büyüme dinamikleri hem morfolojik hem de moleküler olarak incelenmiştir. Ayrıca, laboratuvar yapımı DMEM (LYDMEM) olarak isimlendirdiğimiz ve içeriğini kendimiz birleştirdiğimiz besiyeri, diğer deneylerde kullanılan Hyclone marka (katalog numarası:SH30022) DMEM'in içeriğine ulaşılamadığından, Gibco marka (Katalog numarası:11965-092) DMEM örnek alınarak hazırlanmıştır. Sonrasında, hücrelerin bu DMEM'de farklı FBS derişimlerinde nasıl davrandıkları da gözlenmiştir. Çalışma kapsamında, 3 farklı kanser hücre hattı (YKG-1: Glioblastoma, H2452: Mezotelyoma; OUMS: Kondrosark.oma) ile bir sağlıklı hücre popülasyonu (HUVEC: İnsan Göbek Bağı Endotel Damar Hücreleri) kullanılmıştır. Bitkisel karışımlar ve ticari inek sütü hacimce %2,5, 5, 7,5 ve 10 olarak ticari DMEM'e eklenerek tüm hücrelere uygulanmıştır. Bu besiyerlerindeki hücrelerin hiçbiri çoğalmamış ve 72 saatten itibaren öldükleri gözlenmiştir. Aynı şekilde, ticari DMEM 'e %0, %2,5 ve %10 FBS eklenerek hücrelerin morfolojilerinin nasıl değiştiği her 24 saatte bir çekilen fotoğraflar ile analiz edilmştir. FBS'siz ortamda büyümeye devam eden tek hücre hattı H2452 idir. YKG-1, OUMS ve HUVEC hücreleri için %2,5 FBS, %10 kadar iyi sonuç vermiştir (p>0.05). Ayrıca, hücrelerin 72 saat boyunca besiyerinde tutulmasından sonra bağıl Ki67 mRNA değerleri Real Time-PCR ile belirlenmiştir. Buna göre; %0 ve 2,5 FBS içeren besiyerlerindeki hücrelerin Ki67 seviyeleri %10 FBS'siz ortamdan belirgin şekilde küçüktür (p<0.05). Bunun yanında, laboratuvarda elde ettiğimiz DMEM (LYDMEM) ile değişen FBS derişimleri denenmiş ve LYDMEM ile ticari DMEM arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmemiştir (p>0.05). Sonuç olarak; LYDMEM üretilen besiyerinin ticari DMEM yerine kullanıalbileceği, FBS'in besiyerinde hâlâ önemli bir bileşen olarak görünmesine karşın bu önemin hücre tipine bağlı olduğu ve bu çalışmada denenen tüm hücreler için FBS miktarı %2.5'a düşürülerek laboratuvarın kazançlı duruma getirilebileceği söylenebilir.

The culture media developed for mammalian cells contain substances such as various carbohydrates, proteins, vitamins, and organic salts. One of these media is called DMEM (Dulbecco'sModified Eagle's Medium). Fetal Bovine Serum (FBS) is another important component of the cell medium, and its production involves a painful process which results in death of both mother and baby cattle while causing economic and logistical problems. In this thesis, the growth dynamics of human cells in DMEM containing various amounts of FBS, soybean, almond, coconut or cow's milk were investigated both morphologically and molecularly. In addition, the medium, which we named laboratory-made DMEM (LYDMEM) and whose contents we combined ourselves, was prepared by taking the Gibco brand (Catalog number: 11965-092) DMEM as a sample, since the content of Hyclone brand (Catalog number: SH30022) DMEM used in other experiments could not be reached. Afterwards, it was observed how the cells behaved in this DMEM at different FBS concentrations. In the study, 3 different cancer cell lines (YKG-1: Glioblastoma, H2452: Mesothelioma; OUMS: Chondrosarcoma) and a healthy cell population (HUVEC: Human Umbilical Cord Endothelial Vascular Cells) were used. Plant-based alternatives and commercial cow's milk were added to commercial DMEM at 2.5, 5, 7.5 and 10 vol% and applied to all cells. None of the cells in these media proliferated and all were observed to die after 72 hours. Besides, when 0%, 2.5%, and 10% FBS were added to commercial DMEM and the morphology of cells was analyzed with the photographs taken every 24 hours, it was found that the only cell line continuing to grow in FBS-free media was H2452. For YKG-1, OUMS and HUVEC cells, 2.5% FBS gave as good results as 10% (p>0.05). In addition, the relative Ki67 mRNA values were determined by Real Time-PCR after the cells were kept in the medium for 72 hours. Accordingly, Ki67 levels of cells in media containing 0% and 2.5% FBS were significantly lower than in media without 10% FBS (p<0.05). In addition, DMEM (LYDMEM) obtained in the laboratory and the commercial DMEM containing vvarious FBS concentrations were tested and no statistically significant difference was found (p>0.05). As a result; it can be said that the medium produced in our laboratory (LYDMEM) can be used instead of commercial DMEM, and FBS still appears as an important component in the medium. This importance depends on the cell type, and the laboratory can be made profitable by reducing the amount of FBS to 2.5% for all cells tested in this study.