An integrated computational and experimental approach to allosteric control mechanism of biomolecular processes

Abstract

Proteins are flexible and dynamic in nature and can undergo structural rearrangements to perform their functions. The motivation of this thesis is to develop a novel integrated computational and experimental approach to understand the allosteric control of conformational transitions and molecular recognition. In the first part, a novel methodology called Collective Modes Bias Exchange Metadynamics (CM-BexMetaD) was developed and transition and allosteric control of transition of Adenylate kinase was investigated. In the second part, allosteric control of binding of proteins were studied through Elastic Network Models (ENM), Molecular Dynamics (MD), in-vitro imaging and Dynamic Force Spectroscopy (DFS) using AFM. A strong association between the hinge positions of global modes and allosteric mutations was shown by a large scale statistical analysis. The binding behavior of pyrin domain (PYD) and assembly formation of ASC protein was studied in-silico supported by in-vitro experiments and the results showed that, the ASC speck is an organized structure and the interaction of the domains are controlled via hinge residues. Further, the allosteric control of binding have been elucidated on the kinesin- αβ-tubulin and Rac1-PAK1 interactions by prediction of hinge residues that would affect the binding behavior of proteins and then the resulting change in the binding energy landscape were investigated by DFS and last the mechanistic explanation of the alteration of the allosteric communication network was studied via MD studies. Both kinesin- αβ-tubulin and Rac1-PAK1 protein complexes have alternative dissociation pathways where hinge residues as mechanistically key sites that allosterically control the binding behavior of molecules.

Proteinler esnek ve dinamik yapılardır ve işlevsel yapısal değişimler gösterirler. Bu tezin ana motivasyonu, konformasyonel geçişlerin ve moleküllerin bağlanma süreçlerinin alosterik kontrolünü anlamaya yönelik hesaplamalı ve deneysel entegre bir yöntem geliştirmektir. Oncelikle, kararlı yapılar arasındaki geçişler ve serbest enerji yüzeylerini belirlemeye yönelik, Kolektif Modlar Bayas Değişimli Metadinamik (CM-BexMetaD) olarak adlandırılan özgün bir yöntem geliştirilmiştir. Adenilat kinaz enziminin birçok ara yapısı belirlenmiş ve menteşe bölgelerinin alosterik etkisi gösterilmiştir. Ikinci bölümde, ENM, moleküler dinamik (MD), in-vitro görüntüleme ve Atomik Kuvvet Mikroskopu-Dinamik Kuvvet Spektroskopisi (AFM-DFS) yöntemleri ile proteinlerin bağlanma mekanizmalarının alosterik kontrolu üzerine çalışılmıştır. SKEMPI veritabanindaki mutasyonlar ile menteşe bölgeleri arasındaki kuvvetli ilişki, geniş çaplı istatistiksel bir analiz ile gosterilmistir. In-silico ve in-vitro deneyler ile PYD ve ASC proteinlerindeki menteşe bölgelerindeki mutasyonlarin bağlanma davranışı üzerindeki etkisi çalışılmıştır. ASC zerreciklerinin en az iki seviyeli organize yapılar olduğu ve menteşe bölgeleri aracılığı ile kontrol edildiği belirlenmiştir. Bunlara ek olarak, AFM-DFS yöntemini kapsayan hibrit bir yaklaşım geliştirilerek, protein-protein bağlanma mekanizmalarinin menteşe bölgeleri aracılığı ile alosterik olarak kontrol edildiği, kinezin-αβ-tübülin ve Rac1-PAK1 etkileşimleri üzerinden ortaya konulmuştur. Alosterik haberleşme ağındaki değişimin mekanik izahı ise MD simülasyonları ile belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar ile kinezin-αβ-tübülin ve Rac1-PAK1 kompleks yapılarının alternatif ayrılma patikalarına sahip oldukları ve menteşe bölgelerinin bağlanma davranışlarını alosterik olarak kontrol eden anahtar bölgeler olduğu ortaya konulmuştur.