Mutational analysis of the Arx gene and whole exome sequencing in epileptic encephalopathy patients

Abstract

Epileptik ensefalopati terimi; genellikle erken başlangıçlı (doğumdan sonraki ilk yıl içerisinde), tedaviye cevap vermeyen ve zayıf gelişim ile sonuçlanan epileptik sendromları tanımlamaktadır. EE, monogenik veya kompleks kalıtımlı olabilmektedir. ARX, `homeobox`-içeren bir gen olup, Homeobox protein ARX'ı kodlamaktadır ve normal beyin gelişiminde görev almaktadır. ARX gen mutasyonları; Ohtarahara ve West sendromu gibi EE fenotiplerinde rapor edilmiştir. En sık rastlanan ARX mutasyonu, 24 baz-çiftinden oluşan ve alanin sayısını 20'ye çıkaran polialenin bölge genişlemesidir. Bu polialenin genişlemesi, ayrıca zeka geriliğine yol açmaktadır. EE tanısı yalnızca klinik kriterlere göre yapılamamakta olup, ARX gen mutasyonlarının ve tekrar artışlarının hem tanı hem de tedavi için önemli parametreler olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmanın amacı, epileptik ensefalopatinin genetik temelinin araştırılmasıdır. EE'nin genetik sebepleri heterojen olduğundan, hastalıktan sorumlu varyantların saptanabilmesi için tüm ekzom dizileme yöntemi gerekmektedir. Fakat, tekrar artışları bu yöntemle tespit edilememektedir. Bu nedenle, ilk olarak ARX gen mutasyonları taşıyabileceği düşünülen fenotipik özelliklere sahip EE hastalarında ARX mutasyonları ve tekrar artışları Agilent ve Sanger dizileme yöntemleriyle analiz edilmiştir. Ek olarak, ARX mutasyonu bulunmayan 3 EE hastasında ekzom dizileme yapılarak patolojik aday varyantlar tanımlanmıştır. ARX tekrar analizleri için tekrar bölgesini içeren ekzon 2.1 bölgesi, seçilen 16 EE hastasında Agilent sistemi kullanılarak analiz edilmiş, fakat anlamlı ölçüde baz artışı gözlenmemiştir. Diğer ekzon bölgeleri, PZR ve Sanger dizileme ile bu 16 hastada analiz edilmiş, ancak verilerin FinchTV yazılımı ile analizleri sonucunda ARX gen mutasyonu tespit edilmemiştir. Bunun üzerine, ARX-ilişkili hastalık fenotipine sahip 16 hastadan 3'ünde tüm ekzom dizileme gerçekleştirilmiştir. Ailesel segregasyon analizlerinin ardından CUL4B ve MAP2 gen varyantları 2 hastada EE için en güçlü aday varyantlar olarak belirlenmiştir

The term epileptic encephalopathy (EE) is used to describe epileptic syndromes with generally early onset, within the first year of life, refractory to drug treatment and poor developmental outcome. The genetics of epileptic encephalopathy disorders can be monogenic or complex. ARX gene mutations were observed in epileptic encephalopathy phenotypes such as Ohtahara and West Syndrome. The most common mutation seen in ARX gene is the polyalanine tract expansion, which is due to duplication of a 24 base-pair polyalanine tract that increases the alanine number to 20. ARX is a homeobox-containing gene encoding for Homeobox protein ARX which has roles in normal brain development. The polyalanine expansion in the ARX gene results in intellectual disability. Epileptic encephalopathy diagnosis cannot be solely made based on clinical criteria, and ARX gene mutations and repeat expansions are considered as an important parameter for both diagnosis and treatment. The aim of this study was to explore the genetic basis of epileptic encephalopathy. Genetic causes of EE are heterogeneous; hence, whole exome sequencing (WES) is necessary to reveal the causative variants. However, repeat expansions cannot be detected by WES technique. Therefore, initially ARX gene mutations and repeat expansions in epilepsy patients with EE were analysed by Agilent and Sanger sequencing in patients with ARX-related phenotypes. In addition, WES was performed in 3 patients with EE and without ARX mutations to reveal pathological variants, and candidate variants were determined. For ARX repeat analysis, exon 2.1 part with the repeat region of 16 patients that present ARX-related phenotype was screened using Agilent system, revealing no significant repeat number increase in the patients. Other exon regions were analysed by PCR and Sanger sequencing for the 16 patients. Analyses of Sanger sequencing data using FinchTV software revealed no mutations in the exons of ARX gene. WES was then performed in 3 out of 16 EE patients with ARX-related disease phenotype. After family segregation analysis, CUL4B and MAP2 variants were selected as the strongest candidates responsible for EE phenotype in two patients.