Lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılmış gökkuşağı alabalığı gonad hücrelerinde (RTG-2) Inula viscosa L.'nın etkilerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, gökkuşağı alabalığından izole edilmiş gonad hücre hattı (RTG-2) LPS ile enfekte edilmiş I. viscosa'nın anti-proliferatif ve anti-inflamatuar etkileri incelenmiştir. Ön çalışmalarla farklı konsantrasyonlarda LPS (1, 5, 10 ve 20 µM/ml) ve I. viscosa (IV) (1, 5, 10 ve 20 µg/ml)'nın etkin ve hücreler için toksik doz tespitleri viabilite testleriyle çalışılmıştır. Elde edilen verilere göre, 5 µM/ml LPS konsantrasyonunun kontrol grubuna göre % 2 proliferasyon gösterdiği, 10 ve 20 µM/ml'de sırasıyla %4 ve %27 oranında azalmalar kaydedildiği saptanmıştır. Bu nedenle deneysel enfeksiyon için 20 µM/ml LPS etkin konsantrasyon olarak seçilmiştir. I. viscosa ise 1µg/ml konsantrasyonda kontrol grubuna göre % 1,1'lik hücre proliferasyonu göstermiş, artan konsantrasyonlarla (5, 10 ve 20 µg/ml) hücre canlılığını üzerinde sırasıyla % 1.7, %19 ve % 36 düzeylerinde azaltıcı etkiler kaydedilmiştir. Antisitotoksik etkinliğine sahip I. viscosa'nın1µg/ml konsantrasyonu deneme için kullanılmıştır. Daha sonrasında dört deneysel düzenek kurgulanmıştır. İlk grup kontrol grubu olarak değerlendirilmiş (C), ikinci grup LPS ile enfekte edilmiştir (LPS). Üçüncü grup yalnızca I. viscosa ile muamele edilmiş (IV), son grup LPS ile enfekte edilen gonad hücreleri üzerinde I. viscosa'nın maruziyeti (LPS+IV) ile oluşturulmuştur. I. viscosa esansiyel uçucu yağı su destilasyonu yöntemi kullanılarak temin edilmiştir. Antiinflamatuar etki için hedeflenen IL-1β, IL-8 ve TNF-α genlerinin ekspresyonları qRT-PCR metodu ile belirlenmiştir. IL-6 protein düzeyi tespiti için ELISA yöntemi uygulanmıştır. LPS ile enfekte edilen RTG-2 hücrelerinde araştırılan tüm pro-enflamatuar parametreler up regülasyonlar sergilemiş, en fazla TNF-α gen ekspresyon düzeyinde artış görülmüştür (11.3 kat). LPS maruziyeti sonunda İV eklenen grupta ise down regülasyonlar izlenerek, en fazla etkiyi %96 ile IL-1β göstermiştir. IL-6 protein düzeyi için veriler değerlendirildiğinde, tersi bir durum görülmüş, kontrol grubuna göre LPS tarafından % 4 oranında azalma, LPS maruziyeti sonunda İV eklenen grupta ise yaklaşık %9 oranında artma olduğunu belirlenmiştir. Pro-enflamatuar sitokinler üzerinde I. viscosa'nın etkinliği bu çalışma ile ortaya konularak, LPS inhibisyonu ve LPS'ye karşı IV'nın anti-enflamatuar etkileri olduğu belirlenmiştir. Fakat daha ileriki çalışmalarla I. viscosa'nın farmakoloik etkinliği birçok yönden daha detaylı olarak çalışılmalıdır.

In this study, the anti-proliferative and anti-inflammatory effects of I. viscosa infected with LPS were investigated in gonad cell line isolated from rainbow trout (RTG-2). Preliminary studies were carried out the toxic dose determinations for the cells with different concentrations of LPS (1, 5, 10 and 20 µM/ml) and I. viscosa (IV) (1, 5, 10 and 20 µg/ml) were studied by viability tests. According to the obtained data, it was found that the concentration of 5 µM/ml LPS showed 2% proliferation compared to the control group, and decreases of 4% and 27% were recorded in 10 and 20% µM/ml, respectively. Therefore, 20 µM/ml LPS for experimental infection was selected as the active concentration. I. viscosa showed 1.1% cell proliferation with a concentration of 1µg/ml compared to the control group, reducing effects recorded with increasing effects (5, 10 and 20 µg/ml) on cell viability of 1.7%, 19% and 36%, respectively. The concentration of I. viscosa with anti-cytotoxic activity was 1 µg/ml. Then, four experimental instruments were designed. The first group was evaluated as a control group (C) the second group was infected with LPS (LPS). The third group treated with only LPS (LPS). The last group was formed by exposure of I. viscosa (LPS + IV) on gonad cells infected LPS. The essential essential oil of I. viscosa was provided by the method of water distillation. Expressions of IL-1β, IL-8 and TNF-α genes targeted for anti-inflammatory effect were determined by qRT-PCR method. ELISA method was used to detect IL-6 protein levels. All pro-inflammatory parameters investigated in the cells of RTG-2 LPS-infected cells up-regulated, increased TNF-α gene expression level (11.3 times). In the group with IV added at the end of LPS exposure, down regulation was monitored and the most effect was IL-1β with 96%. When the data for the IL-6 protein level were evaluated, the opposite was seen, it was determined that there was a 4% decrease by LPS compared to the control group and an increase of 9% in the group with IV addition at the end of LPS exposure.The efficacy of I. viscosa on pro-inflammatory cytokines was demonstrated by this study, and LPS inhibition and anti-inflammatory effects of IV against LPS were determined. However, further studies suggest that pharmacological activity of I. viscosa should be studied in more detail in many respects.