İnci Kefali`nden (chalcalburnus tarichi P.1811) asetilkolinesteraz enziminin (EC 3.1.1.7) afinite kromatografisi ile saflaştırılması

Abstract

ÖZET İNCİ KEFALİ'NDEN (Chalcalburnus tarichl P.1811) ASETİLKOLİNESTERAZ ENZİMİ'NİN (EC 3.1.1.7) AFİNİTE KROMATOGRAFİSİ İLE SAFLAŞTIRILMASI ALIRIZ, Serpil Yüksek Lisans Tezi, Kimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı: Yrd.Doç.Dr. Vedat TÜRKOGLU Eylül 2000, 37 sayfa Bu çalışmada, İnci Kefali plazma ve eritrositlerinden asetilkolinesteraz enziminin afinite kromatografisi ile saflaştırılması incelenmiştir. Bu yüzden önce deney için alman balık kanı, antikoagulantlı tüplere konuldu. Bunların eritrosit ve plazması santrifüjle ayrıldı. Ayrılan plazmanın pH'sı 8'e katı sodyum fosfat ile ayarlandı. Böylece kolona tatbik edilecek duruma getirildi. Eritrosit ise %0.9iuk NaCl çözeltisi ile yıkandı. Hacminin 1.5 katı, destile soğuk su ile hemoliz edilerek yarım saat 4°C'de karıştırıldı. Hücre zarlarından ayırmak için ise hemolizat 12000 rpm'de 30 dk santrifüj edilerek ayrıldı. Bunun da pH'sı 8'e katı sodyum fosfat ile ayarlanarak, kolona tatbik edilecek duruma getirildi. Önceden hazırlanan afmite jeli kolona paketlenerek tampon A ile dengelendi. Hazırlanan plazma ve hemolizat ayrı ayrı kolona tatbik edildi. Sonra kolondan tampon B geçirilerek yıkandı. Yıkama işlemine absorbansın 0.01'den küçük olduğu durumda son verildi. En son tampon C geçirilerek 6'şar mi halinde fraksiyonlar toplandı. Bütün bu fraksiyonların kalitatif ve kantitatif protein tayini, esteraz aktivite tayinleri yapıldı. Saflaştırılan enzim çözeltileri diyaliz edilerek, derişik hale getirildi. Sonra SDS-Page elektroforezi ile enzim saflığı kontrol edildi. Spesifik aktivitelerden saflaştırma oranları hesaplandı. Saflaştırma oranları plazma AChE için 325 1.6, eritrosit AChE için ise 8500'dür. Anahtar kelimeler: İnci Kefa/i(Chalcalbumus tarichi P.1811), Saflaştırma, Asetilkolinesteraz enzimi, Afinite kromatografisi.

ABSTRACT THE PURIFICATION OF ACETYLCHOLINESTERASE (EC 3.1.1.7) ENZYME WITH AFFINITY CHROMATOGRAPHY FROM GREY MULLET {Chalcalburnus tarichi P.1811) ALIRIZ, Serpil Master Thesis, Chemistry Main Science Branch SupervisonAsst. Prof. Dr. Vedat TÜRKO?LU September 2000, 37 pages In this study, the purification of Acethylcholinesterase enzyme with affinity chromatography from Grey Mullet {Chalcalburnus tarichi P.1811 ) plasma and erythrocyte have been examined. So, the fish-blood sample taken for the experiment was put into the anticoagulant tubes. Their erytrocyte and plasma were seperated by centrifuge. The pH of the seperated plasma is adjusted to 8 with solid sodium phosphate. Thus, it was prepared for application to column. Erythrocyte was washed with 0.9 % of NaCl solution. It is hemolyzat with distilled cold water 1.5 times its volume and mixed for half an hour at 4 °C. In order to discern from cell-membrane hemolyzat was discerned having been centrifüged at 12000 rpm for 30 minutes. Its pH was prepared for application to column having been adjusted to 8 with solid sodium phophate. Affinity jell, prepared before having been packed to the column was balanced to with tampon A. The prepared plasma and hemolyzat were seperately applied to the column. Then, it has been washed by tampon B have been gone through column. The washing process was stopped when the absorbance was less then 0.01. Finally, the fractions, everyone 6 ml, were collected by tampon C have been gone. Qualitative and quantitative protein determinations and esterase activity determinations of these fractions were done. The purified enzyme solutions were concentrated having been dialized. Then, purity of the enzyme was controlled with SDS-PAGE electrophoresis. Purification rates are calculated from spesific activities. The purification rates for plasma AChE 325 1.6 and for erythrocyte AChE is 8500. Key words: Grey Mullet {Chalcalburnus tarichi P.181 1), Purification Acetylcholinesterase enzyme, Affinity chromatography. in