Koyun karaciğerinden glükoz-6-fosfat dehidrogenaz enziminin (EC 1.1.1.49) afinite kromatografisi ile saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

ÖZET KOYUN KARACİĞERİNDEN GLUKOZ-6-FOSFAT DEHİDROJENAZ ENZİMİNİN (EC 1.1.1.49) AFİNİTE KROMATOGRAFİSİ İLE SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU ALDEMİR, Sinan Yüksek Lisans Tezi, Kimya Anabilim Dalı Tez Danışmanı: Yrd. Doç. Dr. Vedat TÜRKOĞLU Ocak 2002, 51 sayfa Bu çalışma; Koyun Karaciğerindeki Glukoz-6-Fosfat Dehidrojenaz enziminin saflaştırılması için hızlı ve kapsamlı bir saflaştırma yöntemini içermektedir. Bununla birlikte metabolizma için büyük öneme sahip olan bu enzimin bazı özellikleri ve kinetikleride incelenmiştir. Saflaştırma için kullanılacak koyun karaciğeri, gerekli işlemler yapılarak kolona uygulanacak homojenat haline getirildi. Kolona uygulanacak homojenatın pH'sı dengeleme tamponunun pH'sı olan pH=6'ya NaH2P04 (Sodyum Fosfat) ile ayarlandı. Homojenat 2',5'-ADP Sepharose 4B afınite kolonuna uygulandı. Aktivite gösteren fraksiyonların enzim ünitesi, 280 nm'de kalitatif protein tayinleri, 595 nm' de kalitatif protein miktarları tayin edildi. Aynı zaman da; enzim' in optimum sıcaklık, optimum pH ve iyonik şiddet etkisi araştırıldı. En son olarak SDS-PAGE eletroforezi ile enzim saflığı konrol edildi. Yapılan çalışma sonucunda enzimin saflaştırma oranı ve molekül ağırlığı sırasıyla 1.900 kat ve 85.000 da olarak bulundu. Enzimin optimum pH'sı 7.5-9.0, optimum sıcaklığı 45°C olarak bulundu. İyonik şiddet etkisinin araştırıldığı bir başka çalışmada ise en yüksek aktivite 0.10 M NaH2P04 konsantrasyonunda görülmüştür. Optimum pH değeri bir çok çalışma ile tutarlılık göstermektedir. Optimum sıcaklık çalışmasında sonuç beklenenden değişik çıkmıştır. Bu sıcaklık ise yukarıda belirtildiği gibi 45°C'dir. Enzimin saflık derecesi SDS-PAGE elektroforezi ile kontrol edilmiş ve tek bant görülerek saflığı ispatlanmıştır. Anahtar Kelimeler: Koyun Karaciğeri, Saflaştırma, Glukoz-6-Fosfat Dehidrojenaz Enzimi, Afınite Kromatografisi.

ABSTRACT THE PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHIDROGENASE (EC 1.1.1.49) ENZYME WITH AFFINITY CHROMATOGRAPHY FROM SHIP LIVER ALDEMİR, Sinan Msc, Chemistry Science Thesis Advisor: Asst. Prof. Dr. Vedat TÜRKO?LU January 2002, 5 1 pages This study represents a rapid and extensive method of purification for purificating the Glucose- 6- Phosphate Dehidrogenase enzyme in ship liver. In addition, the analyse of some features and kinetics of this enzyme which is extremely important for metabolism is existing. Doing necessary operations, the ship liver which is going to be used for purification was turned into homogenate that will be applied to the column. The pH of homojenate which is going to be the pH=6 which is the pH of balancing buffer, by NaH2P04 (Sodium `phosphate). The homogenate was applied to 2',5'- ADP Sepharose 4B affinty column. The value of Enzyme Unit in activated fractions was calculated. Also, the rations of Quantitative protein in 595 nm and Qualitative protein in 280 nm for determination of protein amount were appointed. In the same time, the optimum temperature, optimum pH, and ionic strenght reaction of the enzyme were searched. At last pure of the enzyme was checked by SDS-PAGE electrophoresis. In the result of the study proportion of enzyme purification and molecule weight has found 1.900 fold and 85.000 da, respectively. The optimum pH of the enzyme is 7.5-9.0 and optimum temperature is 45°C. The highest activity was seen in consantration of 0.10 M (NH4)2S04 in another study in which the ionic strenght was searched. The value of the optimum pH was accurate in many studies. The result of the optimum temperature was calculated as 45°C, different from the result expected. The enzyme purification degree checked by SDS-PAGE electrophoresis study and it was seen a single band on jel that demonstrated the pure of enzyme. Key words: Ship Liver, Purification, Glucose- 6- Phosphate Dehidrogenase Enzyme, Affinity Chromatography. in