İnsan granuloza hücre kinetiği, proliferasyonu ve apoptozisin gerçek zamanlı ve kantitatif olarak belirlenmesinde yeni bir impedans(iç direnç) bazlı metod: xcelligence

Abstract

Amaç: Kanser tedavisinde kullanılan ilaçların ovaryen toksisitesinin gerçek zamanlı ve kantitatif olarak değerlendirilebilmesi, fertiliteyi koruma bakış açısı ile bakıldığında son derece önemlidir. xCelligence böyle bir amaca hizmet eden yeni bir teknolojidir. Bu yeni sistem, kültür tabağının tabanına yerleştirilmiş birbirine kenetlenmiş mikro-elektrodlarda elektriksel impedansı ölçerek hücre proliferasyonu, viabilitesi ve sitotoksisite hakkında gerçek zamanlı kantitatif veriler vermektedir. Bu metod sayesinde hücrelerin önceden herhangi bir işleme tabi tutulması veya işaretlenmesi gerekmemektedir. Bu projede xCelligence sisteminin kemoterapi ilaçlarının granulosa hücrelerine olan sitotoksisitesini analiz etme yeteneğini belirlemeyi amaçladık.Yöntem ve Gereçler: İmmortalize granuloza hücreleri (COV434) bu amaçla seçildi. Hücreler E-96 kuyucuklu hücre kültürü tabağına farklı yoğunluklarda ekildi (625-40,000 hücre kuyucuk). Hücreler log fazına ulaştıklarında TAC kemoterapi kombinasyonu 4 farklı dozda (0.625-1.25-2.5-5 ng/mL) verildi. Viable hücre sayısı normalize hücre indeksi (CI) olarak belirtildi. Metodun güvenilirliğini kıyaslamak için eş zamanlı immünofloresans metodu ile apoptosis bakıldı. Sonuçlar: Farklı yoğunluklarda ekilen hücreler, ekilme yoğunluklarına ile uyumlu büyüme eğrileri çizdiler. Yüksek yoğunlukta ekilenler log ve plato fazlarına daha erken ulaştılar (Şekil 1A). Kemoterapi uygulanmasından sonra, 5 saat gibi kısa bir süreden itibaren doza bağlı olarak hücre indekslerinde azalma eğilimi gözlendi. Kültürün sonunda, kemoterapi gruplarındaki ortalama hücre indeksi, kontrol grubuna kıyasla anlamlı olarak düşük bulundu. Kontrol hücrelerinin yalnızca %6'sı aktif caspase-3 için pozitif boyanma gösterirken, TAC gruplarında bu oran %50 idi (p<0.001)Sonuç: Sonuçlarımıza göre, xCelligence teknolojisi ile herhangi bir medikal ajan veya bileşenin gonadotoksisitesi kolayca test edilebilir ve IC50 değerleri bulunabilir.

Background: The randomized clinical trials addressing whether or not GnRH agonists offer protection against ovarian damage induced by toxic chemotherapy regimens yielded conflicting results. Therefore we aimed in this study to determine if GnRH agonist leuprolide acetate protects human granulosa cells from apoptosis induced by chemotherapy.Methods: Human immortalized (COV434) and luteal granulosa cells (LGC) expressing GnRH receptor were treated with TAC chemotherapy regimen (docetaxel, adriamycin and cyclophosphamide) at 0.6-1.2-2.5-5 ng/mL concentrations, which correspond to their lowest and peak blood levels. For each concentration of TAC regimen GnRH agonist leuprolide acetate was used at three different concentrations (12.5-25-50 ng/mL), which reflects blood and follicular fluid concentrations of the drug. Cell viability/proliferation was monitored real-time using xCelligence SP system and apoptosis with cleaved caspase-3 expression. Results: The cells were treated at log phase with chemotherapy ± GnRH agonist. As shown in Fig-1A, the cells exposed to TAC regimen exhibited first dose-dependent growth arrest and then underwent apoptosis as early as 5 hrs after administration of the drugs. The addition of GnRH agonist did not offer any protective effect against apoptosis as evidenced by comparable growth curves and apoptotic indices of the cells treated with and without GnRH agonist. Overall the mean apoptosis rates in TAC and TAC+GnRH groups were significantly higher than controls (74% and 84% vs. 4%, p<0.001; respectively) Conclusion: These results provide molecular evidence that GnRH agonists may not offer protection against ovarian damage induced by chemotherapy.