Purification and characterizatin of glucose 6-phosphate dehydrogenase from japanese quail erythrocytes

Abstract

Yüksek lisans tezi olarak sunulan bu çalışmada karbohidrat metabolizmasının önemli bir enzimi olan glukoz 6-fosfat dehidrogenaz (G6PD; EC 1.1.1.49) enzimi bıldırcın eritrosit dokularından 60,40 EU/mg spesifik aktiviteyle ve %77,17 verimle 2',5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Bıldırcın eritrosit G6PD enzimi için saflaştırma katsayısı 4137 olarak bulundu. Enzim için yapılan karakterizasyon çalışmalarında; stabil pH Tris-HCl tamponu pH 7,5, optimum pH Tris-HCl tamponu pH 8,0, optimum sıcaklık 65 oC, optimum iyonik şiddet 1 M Tris-HCl tamponu olarak bulundu. Enzimin saflığını kontrol etmek ve alt birim molekül kütlelerini tespit etmek amacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve tek bant gözlendi. Bıldırcın eritrosit G6PD enziminin alt birim molekül kütlesi yaklaşık 78,8 kDa olarak hesaplandı. Son olarak enzimin KM ve Vmax değerleri sırasıyla NADP+ koenzimi için 0,001 mM ve 0,124 EU/mL, G6P substratı için 0,012 mM ve 0,05 EU/mL olarak bulundu.

In this master's thesis study, glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD; EC 1.1.1.49) which is an importance enzyme for the carbohydrate metabolism, was purified from quail's erythrocyte and characterized. The purification was performed by preparation of hemolysate and 2', 5'-ADP Sepharose-4B affinity chromatography. G6PD from quail's erythrocyte was obtained with a yield of 77.17% having a specific activity of 60.40 EU/mg. protein. The overall purification fold was around 4137. The characterization studies were showed: the stable pH value of enzyme to be 7.5 in Tris-HCl buffer, optimum pH value to be 8.0 in Tris-HCl buffer. The optimum temperature was found at 65oC and the optimum ionic strength at 1 M Tris-HCl. Molecular weight of G6PD enzyme from quail's erythrocyte was determined as 78.8 kDa by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Finally, the KM and Vmax values for substrate (G6P) and coenzyme (NADP+) of the G6PD enzyme were calculated. KM and Vmax values for the NADP+ coenzyme found as 0.001 mM and 0.124 EU/mL respectively, and the KM and Vmax values for G6P substrate found as 0.012 mM and 0.05 EU/mL respectively.