Anilin mavisi boyasının farklı fiksatiflerle uygulanması ile sperm kromatin kondansasyonunun incelenmesi

Abstract

Amaç: Sperm kromatini DNA ve nükleer proteinlerinin sıkı bağ yapması ve kompaktlaşması ile düzenlenmektedir.Bu kompaktlaşma sonrası normal kişilerde yaklaşık olarak %85-%15 protamin ve histon olacak şekilde nükleer protein yapısı kurulmaktadır.Yapılan çalışmalar sperm nukleusundaki protamin ve histon düzeyinin DNA hasarları ve infertilite ile yakın ilişkisi olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada klasik histon boyama yöntemi olan Anilin mavisi yönteminin dört farklı fiksatif uygulayarak kantitatif olarak kromatin kondansasyon oranlarını ne düzeyde etkilediğini araştırmayı amaçladık.Materyal Metod: Bu çalışmada 42 semen örneğinde yayma preparatlar yapılarak ,her örnek için 4 ayrı semen yayması hazırlandı . Bu preparatlar ,glutaraldehit (%2,5), Formaldehit (% 10), Etil alkol (%98) ve metanol+asetik asit (3/1) ile fikse edildi.Fikse edilen her örnek asidik anilin mavisi ile 7 dakika boyandı ve fosfat tampon ile yıkandı, kurutuldu ve immersiyon objektifinde incelendi . Analiz için her preparatta 200 sperm sayıldı,boya alan ve almayan sperm oranları çıkarıldı.Farklı fiksatifler arasında kromatin kondansasyon(anilin negatif) oranları arasındaki farklılıkları hesaplama amacı ile student's -T testi ve tekrarlı ölçümlerde varyans analizi uygulandı.Bulgular: Dört fiksatif arasından Glutaraldehit ve Formaldehit arasında pozitif korelasyon( p=0,051), Glutaraldehit ve formaldehit ile methanol+asetik asit ve alkol fiksasyonu arasında negatif korelasyon bulunmuştur (p==,0005,p=0,0005 ve p=0,0005, p=0,007).Tartışma: Bu çalışmada elde edilen sonuçlara göre sperm kromatin kondansasyonu için uygulanabilecek olan boya Anilin mavisi boyası için hücrelerin % 2,5 Glutaraldehit ve %10 formaldehit fiksasyonunun uygun olabileceği , metanol+asetik asit ve etil alkol fiksasyonunun ise uygun olmadığı kanısına varılmıştır.

Objective:Sperm chromatin is formed by tight injunction and compactness of DNA and nuclear proteins. Approximately 85%-15% protamin and nuclear protein structure is formed to be histone in normal people after compactness. Researches have shown that level of protamin and histone in sperm nucleus has a close relationship with DNA damage and infertility. In this study, we aim to research to what extent aniline blue method which is the common histone dying method affects the chromatin condensation rates quantitatively by applying four different fixatives.Material and Methods:In this study, 4 different semen smear is prepared for each sample by making smear preparates in 42 semen samples. These preparates are fixed with Glutaraldehide (2,5%), Formaldehyde (10%), Ethyl alchol (98%) and methanol+acetic acid (3/1). Each sample fixed is dyed for 7 minutes for acidic aniline blue and washed with phosphate buffer, dried and examined at immersion objective. 200 sperms are counted at each preparate for analysis, sperm rates receiving and not receiving dye are removed. Student's -T test and variance analysis was applied with repeated measures in order to calculate differences between chromatin condensation (aniline negative) rates among different fixatives.Results