Isolation, purification myelin basic protein (MBP) and generation specific antibodies against its

Abstract

Temel miyelin proteinleri (MBP) miyelin kılıfının oluşumunda önemli rol oynayan dış membran proteinleridir. MBP izoformları Oligodendrosit (OLG) ailesinde bulunan Golli geninden 14-21,5 kDa arası değişen büyüklükte kalıtılan sorunlu proteinlerdir.. Miyelin proteinleri merkezi sinir sisteminde (CNS) çok tabakalı miyelin kılıfın konfigürasyonunda önemli bir yere sahiptir. MBP'nin 18,5 kDa'lik klasik izoformu ensefalitojenik belirteç olarak 50 yıldan fazla bir süre önce izole edildi. Bu protein merkezi sinir sistemi miyelininin yapısına katılan bir proteindir ve electron mikrograflarında gözlemlenen ana belirgin line oluşturmak için oligodendrosit tabakasının sitoplazmik leafletlarını biribirine bağlar. MBP'nin bu önemli rolü MBP geni susturulmuş, CNS miyelin oluşumu çok az olan ve yapısal olarak tam olmayan mutant farede ortaya çıkarılmıştır. Bu çalışmada MBP proteini rat beyninden 600 mg doku homojenize edilerek izole edilmiştir. Rat beyin homojenatı suda çözünebilen proteinleri ayırmak için santrifüj edilmiştir. Homojenat 14000 rpm'de 60 dk santrifüj edilerek pellet deneyde kullanılmıştır. Lipidleri ayırmak için pelete methanol-aseton solusyonu eklenmiştir. 45 dk +4 C0'de inkübasyondan sonra pellet 14000 rpm'de 30 dk santrifüj edilip pellet elde edilerek asit tamponu (pH=2) kullanılarak MBP ekstraksiyonu yapılmıştır. Elde edilen ekstrakt 60 dk +4 C0'de karıştırılmıştır. Ekstrakt 14000 rpm'de 30 dk boyunca santrifüj edildikten sonra MBP'nin SDS/PAAG yöntemi ile pürüfikasyonu için kullanılmıştır. Gel polipeptidinden 18 kDa olarak elde edilen protein tavşanda bağışıklık oluşturmak için antijen olarak kulanılmıştır. Western blotta antikor titresi, bir membran üzerinde boyanan ana MBP polipeptidlerinin yoğunluğunu azaltmaksızın görünür sonuçlar için maksimum seyreltme olarak belirlendi. Anti-MBP antikorları için maksimum seyreltme oranı 1:5500 olarak çalışılmıştır. IgG fraksiyonunun pürüfikasyonu ile 18,5 KDa izoformunu içeren rat beyninden MBP'nin spesifik antikorları elde edilmiştir. Elde edilen MBP'nin spesifik antikorları miyelin üretim bozukluğu ile alakalı hastalıklar ve oligodendrosit patolojisi çalışmak için başarılı bir şekilde kullanılabilir.

Myelin basic proteins (MBP) are extraneous membrane proteins that play an essential role in the original organization of the myelin sheath. The classic (MBP isoforms are inherently disordered proteins of 14-21.5 kD gain size emerging from the Golli Gene in the Oligodendrocyte Lineage) gene combination, and are accountable for configuration of the multilayered myelin sheath in the central nervous system. The 'classic' 18.5-kDa isoform of myelin basic protein (MBP) was primary isolated more than 50 years ago as an encephalitogenic determinant. This protein is an integral part of central nervous system (CNS) myelin, adhering the cytoplasmic leaflets of the oligodendrocyte (OLG) layer to each other to form the major dense line observed in electron micrographs. This essential role is manifestation by mutant mouse which has an ablation in the MBP gene, and whose CNS myelin is rare and relatively unstructured. In this study MBP was isolated from rat brain 600 mg brain tissue and homogenized. Buffer for homogenates contain the cock tail of the inhibitors proteases benzamidine, leupeptine and PMSF. Rat brain homogenate was centrifuged for a separation of water-soluble proteins. The rat brain homogenate centrifuged for 14000 rpm 60 min and after the pellet collect. This pellet mixed and resuspend with methanol-aceton solution for delipidation. Later 45 min incubation in +4 C0 this mix centrifuged for 30 min 14000 rpm and after the pellet collect. Obtained pellet was used for extraction MBP with acid buffer pH 2.0. The extraction was performed 60 min at +4 C0 with permanent mixing. After centrifugation for 30 min 14000 rpm this extract was used for isolation and purification MBP by SDS/PAAG. Extracted from gel polypeptide with Mm 18 kDa was used as antigen for rabbit immunization. The titer of antibodies in western blot was determinate as maximum dilution for visible results without decreasing intensity of main MBP polypeptides staining on a membrane. This maximal dilution for anti-MBP antibodies was 1:5500. Purification of IgG fraction resulted to obtain specific antibodies against pure MBP from rat brain containing mainly the 18.5 KDa isoform. Obtained specific antibodies against MBP may be successfully used for study demyelinated diseases and olygodendrocyte pathology.