Deciphering the role of Knockdown tigar in the lung cancer cell line through regulation programmed cell death

Abstract

Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri ölümcül bir malignite ile yüksek mortalite oranına sahiptir. siRNA, gen ifadesinin negatif düzenleyicileri olarak transkripsiyon sonrası süreçte protein kodlayan genlerin kısa süreli susturulmasını indüklemek için en yaygın kullanılan RNA interferens aracıdır. TIGAR proteini,glikoz metabolizması sırasında Fru-2, 6-P2 seviyelerini kontrol eder ve NADPH düzeyini devam ettirerek hücre içi önemli birantioksidan olan GSH'nin geri dönüştürmesine yardımcı olur. TIGAR'ın işlevlerinden biri, hücrelerdeki Fru-2, 6-P2 seviyelerini düşürmek ve sonuç olarak hücre ölümüne karşı daha yüksek dirençle korele olan ROS'u baskılamak ve glikolizi azaltmaktır. Bununla birlikte, siRNA'nın hücre canlılığı, oksidatif stres ve programlanmış hücre ölümleri üzerindeki etkileri veya siRNA'nın akciğer kanseri hücrelerinde TIGAR ile nasıl etkileştiği hakkında pek az şey bilinmektedir. Bu çalışma, A549 hücre hattında TIGAR'ın susturulmasının altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için tasarlanmıştır.siRNA-TIGAR'ın A549 akciğer kanseri hücreleri üzerindeki etkisini saptamak için hücre canlılığını, koloni oluşumunu, ROS ve NADPH'nin oksidatif stres seviyelerini ve hücre canlılığını ölçmek için sırasıyla hücre proliferasyonu, koloni oluşumu, ROS ve NADPH analizleri gerçekleştirdik. Ek olarak, protein ve mRNA ekspresyon seviyelerini ölçmek için sırasıyla western blot ve real-time PCR analizleri kullanıldı.A549 hücre hattında TIGAR inaktif edildikten sonra çeşitli parametreler analiz edildi ve TIGAR'ın down regülasyonunun canlılığı inhibe ettiği ve koloni oluşumunu azalttığı gösterildi. Ayrıca TIGAR inaktivasyonunun apoptozis ve otofajiyi tetiklediği görüldü. Artmış ROS seviyeleri ve azalmış NADPH seviyelerine bağlı olarak oksidatif stres belirteçlerinin indüksiyonu gözlemlendi. Özetle, siRNA TIGAR hücre canlılığını inhibe edip programlanmış hücre ölümlerini (I, II) arttırmıştır ve ROS seviyesini artırarak yüksek oksidatif stres markırlarını yüksek düzeylere çıkarmıştır. Bulgular, TIGAR'ı susturmanın hücre canlılığı inhibisyonunu indüklediğini, ROS seviyelerini artırdığını, NADPH düzeylerini azalttığını, otofaji, apoptosis ve oksidatif stres belirteçlerini indüklediğini gösterdi. Genel olarak, bu çalışma kanser tedavisinde terapötik bir hedef olarak kullanılmak üzere akciğer kanseri hücrelerinde programlanmış hücre ölümü I, II'yi arttırmak için TIGAR susturmanın muhtemel rolünün anlaşılmasını desteklemektedir.

Non-small cell lung cancer has a high mortality rate with a lethal malignancy. siRNA is the most-commonly used RNA interference tool for inducing short-term silencing of protein-coding genes in the post-transcriptional process as negative regulators of gene expression. The TIGAR protein controls Fru-2, 6-P2 levels during glucose metabolism and helps maintain NADPH levels to recycle GSH, a key intracellular antioxidant. One of TIGAR's functions is to lower Fru-2, 6-P2 levels in cells, consequently decreasing glycolysis and suppressing ROS, which correlates with higher resistance to cell death. However, little is known about the effects of siRNA on cell viability, oxidative stress, and programmed cell deaths, or about how siRNA interacts with TIGAR in lung cancer cells. The present study was designed to investigate the molecular mechanisms underlying TIGAR knockdown in the A549 cell line.To detect the influence of siRNA-TIGAR on A549 lung cancer cells, we performed cell proliferation, colony formation, ROS, and NADPH assays to measure cell viability, ability of cells to form colonies, and oxidative stress levels of ROS and NADPH, respectively. In addition, western blotting and real-time PCR assays were used to measure protein and mRNA expression levels, respectively.After TIGAR-knockdown in A549 cell lines, various assay parameters were analyzed and showed that down-regulation of TIGAR inhibited viability and decreased colony formation. We also demonstrated that TIGAR knockdown induced apoptosis and autophagy. Furthermore, increased ROS levels and decreased NADPH levels were observed, followed by an induction of oxidative stress marker expression. In summary, siRNA TIGAR inhibited cell viability, enhanced programmed cell deaths (I, II), and elevated oxidative stress markers by increasing ROS levels.The data showed that TIGAR knockdown induced inhibition of cell viability; increased ROS levels; and decreased NADPH levels, induction of autophagy and apoptosis, and oxidative stress markers. Overall, this study supports our understanding the possibility of using TIGAR knockdown in lung cancer cells to enhance programmed cell death I, II for further use as a therapeutic target in cancer treatment.