Hepatosellüler karsinomada kemik morfojenik protein 9 (BMP9)`un siRNA ile baskılanarak fonksiyonel analizi

Abstract

Hepatosellüler karsinoma (HSK) genelde kronik karaciğer zemininde gelişenkaraciğerin primer bir tümörüdür. Kronik karaciğer hastalığı zemininde gelişen HSKon yıllar boyunca mevcut cerrahi ve cerrahi uygulanamayan vakalardakemoembolizasyon, kemoterapi, alkol enjeksiyonu, radyofrekans ablasyonu gibiyöntemlerdeki gelişmelere rağmen sağkalım oranlarında önemli bir değişimolmamıştır. Mevcut tedavilerin yetersiz kalmasında en büyük etken, kanserinbaşlangıç ve sonraki büyüme mekanizmalarının bilinememesi, erken teşhisinyapılamamasıdır.Son yıllarda en heyecan verici buluş küçük engelleyici RNA (siRNA)'larıngen sessizleştirilmesinde kullanılabiliyor olmasıdır. Mekanizma olarak RNAi (RNAinterferans), gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli rol oynayan bir sistemdir.Kemik Morfojenik Protein (BMP), büyüme faktörlerinin geniş bir ailesi olanTransforme edici büyüme faktörü beta ailesinin (TGF-β) bir üyesidir. BMP ailesininalt üyesi olan BMP9, hücre farklılaşmasında, çoğalmasında, büyümesinde, apoptozdaönemli rol oynamaktadır. BMP9 ekspresyon analizi, BMP9 proteininin hepatositlerve intrahepatik safra yolu epitel hücreleri tarafından üretildiğini göstermektedir. Bu çalışmada; HepG2 insan hepatosellüler karsinoma hücre hattı, BMP9genine özgü siRNA ile transfekte edilerek BMP9 geninin ne kadar sessizleştirildiğive gen ekspresyon düzeyi total RNA kullanılarak qRT-PCR'da belirlenmiştir. Aynışekilde BMP9 sinyal yol alt bileşenleri olan SMAD1/5/8, SMAD4 ve hedefgenlerden p21, Id1 ve Id2 genlerinin ekspresyonları bu genlere özgü mRNAprimerleri tasarlanarak bloke edilip edilmediği ortaya konuldu. Bununla beraberprotein seviyesindeki değişiklikleri gözlemleyebilmek için de BMP9 ve alakalı diğerproteinler Western Blotting yapılarak teyit edilmesi sağlanmıştır. Bu sessizleştirmenin hücre çoğalmasını nasıl etkilediği xCELLigence Gerçek ZamanlıHücre Analiz Sistemi ile ortaya konmuştur. Elde edilen sonuçlar incelendiğinde, HepG2 insan hepatosellüler karsinomahücre hattında BMP9-siRNA kullanımı sonucu en etkili susturmanın 48.saatte 25nMkonsantrasyonda (%64) olarak belirlendi. Aynı zamanda BMP9, HepG2 hücrelerindehücre proliferasyonunu susturduğu (baskıladığı) da ortaya konmuştur. Sonuç olarakhepatosellüler karsinomada önemli rol olan BMP-9 geninin siRNA yöntemikullanılarak sessizleştirilmesi ve hepatosellüler karsinoma oluşum mekanizmalarındaen önemli aşamalardan biri olan bu sürecin tedavisinin mümkün kılınacağını vekanser tedavisinde oldukça faydalı bir araç olabileceği belirlendi. Anahtar Sözcükler1. Kanser2. Hepatosellüler karsinoma3. BMP94. RNAi5. siRNA

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary tumor of the liver that generallydevelops as a result of chronic liver disease. Available treatments include surgery, orin cases in which surgery is not a viable option, treatment methods such aschemoembolization, chemotherapy, alcohol injection and radiofrequency ablation areused. Despite decades of developments in these treatments for HCC, there has beenno significant change in the survival rate for patients with this disease. The majorfactors that contribute to the insufficiency of treatment is the fact that early diagnosisis not possible, there is insufficient understanding of how this cancer develops, andlittle knowledge of subsequent growth mechanisms.In recent years, the most exciting finding has been the possible use of smallinterferingRNA (siRNA) for gene silencing. The mechanism involved, RNAinterference, plays an important role in regulation of gene expression. Bone morphogenetic proteins (BMP) makes up a large family of growthfactors and is a member of the TGF beta (TGF-β) family. One of the members of theBMP family, BMP9, plays an important role in cell differentiation, proliferation,growth and apoptosis. Expression analysis has shown that BMP9 is produced byhepatocytes and intrahepatic and biliary tract epithelial cells.In this study, using transfection of BMP9-specific siRNA to a humanhepatocellular carcinoma cell line (HepG2), we show gene knock-down using qRTPCR.We analyze the expression of genes in the BMP9 pathway including SMAD1/5/8, SMAD4 and target genes p21, Id1 and Id2. In addition, we also analyzedchanges in protein expression of these genes using Western Blot. To determine theeffect of BMP9 siRNA-mediated knock-down on cell proliferation, we used thexCELLigence real-time cell analysis system. The most significant level of BMP9 knock-down (64%) was seen with a doseof 25 nM at 48 hours after transfection of HepG2 cells. It is also shown that BMP9reduces proliferation in HepG2 cells. In conclusion, using siRNA silencing of BMP9,which is known to play an important role in HCC, we show that this gene plays animportant role in development of HCC and that suppression of this gene could beused in cancer treatment. Keywords1. Cancer2. Hepatocelluler carcinoma3. BMP94. RNAi5. SiRNA