Hematopoetik hücrelerin üretilmesi, çoğaltılması ve farklılaşmasında görevli epo ve tpo`nun medikal biyoteknolojik ürün olarak üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Hematopoetik büyüme faktörleri kan hücrelerinin çoğalmasını ve farklılaşmasını uyaran sitokinlerdir. Eritropoetin (EPO) ve trombopoetin (TPO) başlıca hematopoetik büyüme faktörlerindendir. Eritropoetinin kırmızı kan hücrelerinin oluşumu üzerindeki etkisi iyi bilinmektedir. Trombopoetin megakaryopoezi ve trombosit oluşumunu uyarmaktadır. Hematopoez sırasında, EPO ve TPO sinerjik ve antagonistik bir şekilde etkileşime girebilmektedirler. EPO ve TPO, reseptör bağlama alanlarında önemli bir homoloji sergilemektedirler (% 20 özdeşlik ve % 25 benzerlik). Bu tez çalışmasında, insan EPO proteininin rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak bakteriyel ekspresyon sisteminde üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın üç amacı, biyoinformatik çalışmalar yapılarak E.coli pET30a ekspresyon sistemine klonlanmış halde dizinin temin edilmesi; E.coli BL21 pLysE hücrelerine transformasyonu sonucunda rekombinant olarak ekspresyonu ve saflaştırılması; endotel hücreler için biyolojik karakterizasyonunun belirlenmesidir. Transforme hücrelerin seçimi uygun antibiyotikli besiyerinde gerçekleştirilmiştir. EPO His-etiketi ile eksprese edildi ve Nikel temelli afinite kromotografisi teknikleri saflaştırma amacı ile kullanılmıştır. SDS-PAGE yöntemi ile kalitatif olarak analiz edilmiştir. Bu çalışmada üretilen rekombinant EPO'nun biyolojik olarak aktifliği insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) kullanılarak yapılan poliferasyon analizi ile belirlenmiştir. Bununla birlikte; insan TPO proteininin rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak maya ekspresyon sisteminde üretimi için çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, biyoinformatik çalışmalar sonunda elde edilen pPIC3.5K-TPO vektörü yapay olarak temin edilmiştir. pPIC3.5K-TPO kontsrüktü lineer hale getirilmiştir. Fakat Pichia pastoris GS115 kompetent hücrelerine tranformasyonu ve Pichia pastoris genomuna entegrasyonu sağlanamamıştır.

Hematopoietic growth factors are cytokines that stimulate the proliferation and differentiation of blood cells. Erythropoietin (EPO) and thrombopoietin (TPO) are the main hematopoietic growth factors. The effect of erythropoietin on the formation of red blood cells is well known. Thrombopoietin stimulates megakaryopoiesis and platelet formation. During hematopoiesis, EPO and TPO may interact in a synergistic and antagonistic manner. EPO and TPO exhibit significant homology in the receptor binding domains (20% identity and 25% similarity). In this thesis, human EPO protein was produced in bacterial expression system using recombinant DNA technology. The three objectives of this study were to provide the sequence cloned into the E. coli pET30a expression system by bioinformatics studies; Recombinant expression and purification by transformation into E.coli BL21 pLysE cells; Biological characterization for endothelial cells. The selection of transformed cells was carried out on the appropriate antibiotic medium. EPO was expressed with His-tag and Nickel-based affinity chromatography techniques were used for purification. It was analyzed qualitatively by SDS-PAGE method. The biological activity of the recombinant EPO produced in this study was determined by the polylation analysis using human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). However; Studies have been carried out for the production of human TPO protein in yeast expression system using recombinant DNA technology. In this study, pPIC3.5K-TPO vector obtained as a result of bioinformatics studies is artificially provided. The pPIC3.5K-TPO construct was linearized. However, the transformation of Pichia pastoris GS115 into competent cells and its integration into the Pichia pastoris genome could not be achieved.