Hapatit E virüsü yapısal proteinlerinin (ORF2, ORF3) ekspresyonu, karakterizasyonu, klinik tanı ve aşı çalışmalarında kullanımı

Abstract

ÖZET Bu çalışmamızda, tropikal ve subtropikal bölge ülkelerinde milyonlarca insanın sağlığını etkileyen hepatit E virüsünün (HEV), Hindistan izolatının yapısal bölgeleri ORF2 ve ORF3'ün E.Coli'de, memeli hücrelerinde ve in-vitro eşleşmiş transkripsiyon-translasyon sisteminde ekspresyonu gerçekleştirildi. Eksprese proteinlerin immünoreaktiviteleri Western Blot analizi ile gösterilirken, insan ve laboratuvar hayvanlarında elde edilmiş poliklonal antikorlar immünopresipite edildi. Pürifiye eksprese proteinler, hepatit E virus infeksiyonu tanısına yönelik Western Blot analizi geliştirme çalışmalarında kullanıldı. Anti-HEV ORF3 IgM antikorlarının akut HEV infeksiyonunda en güvenilir tanı markın olduğu gösterildi. Mevcut serolojik tanı kitlerinde kullanılan pORF2'nin, farklı poliklonal antikorlar ile çapraz pozitif reaksiyonlar verdiği ve endemik ülke Hindistan'da sağlıklı insan kan numunelerinde %99 oranında kuvvetli pozitif ve hiç HEV infeksiyon seroprevelansı bildirilmemiş Küba'dan kan örnekleri ile ise zayıf ta olsa pozitif reaksiyon verdiği gösterildi. Pürifiye rekombinant HEV ORF2 ve ORF3 proteinlerle immunize edilmiş laboratuvar hayvanlarından yüksek konsantrasyonlarda poliklonal antikorlar elde edildi. Bu antikorların kullanıldığı antijen yakalama-PCR (AC-PCR) ve afiniti yakalama (Affinity capture-PCR) teknikleri, HEV infeksiyonu moleküler tanısına yönelik olarak optimize ve modifiye edildi. Antijen yakalama ve afiniti yakalama - PCR tekniklerinin, konvansiyonel RNA ekstraksyonuna dayanan PCR tekniğine göre çok daha kolay, masrafsız, uzman eleman gerektirmeyen teknikler olduğu ve RNA 163ekstraksiyonu göre hassas olduğu gösterildi. HEV'un insandan atılımının klinik tablo oluşmadan gerçekleştiği bilinmektedir. Bu yüzden HEV'un atık sularda ve biyolojik sıvılarda varlığının gösterilmesi, virüsün moleküler epidemiyolojisinin anlaşılmasında ve hastalığın yayılımının kontrolünde çok önemlidir. Nükleik asit ekstraksiyonuna dayalı PCR tekniklerinde yanlış negativite sonuçlarına neden olan PCR inhibitörlerini ortadan kaldıran antijen ve affiniti yakalama-PCR teknikleri, modifiye formları ile de rutin klinik laboratuvarlar için otamasyona açık olduğu gösterildi. Pürifiye rekombinant HEV ORF2 ve ORF3 polipeptidleri ve pSG-1 vektör içine klonlanmış 0RF2 ve ORF3 plasmid DNA'lan kullanılarak gerçekleştirilen deneysel aşı çalışmaları ile HEV infeksiyonuna karşı yapısal bölge proteinlerinin koruyucu etkisi araştırıldı. Her iki aşı çalışmasında da, yüksek dilüsyonda anti-HEV antikorları elde edildikten sonra HEV deneysel infeksiyonu gerçekleştirildi. Biyokimyasal olarak korunma gözlenirken, karaciğer ve serumda HEV RNA pozitif olarak tesbit edildi. Eukaryotik ekspresyon promotoru ve enhancerları taşıyan pSG-1 plasmid vektör içine klonlanmış HEV ORF2 ve ORF3 yapısal bölgeleri memeli hücrelerinde ve in-vitro eşleşmiş transkripsiyon-translasyon sistemi kullanılarak eksprese edildi. Memeli hücrelerine transfeksiyon lipozomal taşıyıcılar kullanılarak gerçekleştirildi. Anti-HEV ORF2 ve anti-HEV ORF3 poliklonal antikorları kullanılarak eksprese proteinler immünopresipite edildi. Çalışmalarımızda ORF2 ve ORF3 proteinlerini memeli hücrelerinde doğal ortamda ve in-vitro translasyon sisteminde eksprese ederek moleküler karakterizasyonu ve protein protein ilişkisi incelendi. Pulse chase analizi ile eksprese proteinlerin hücre içi gelişim süreci incelendi. Memeli hücrelerinde pORF3'ün 13.5 kD ağırlığında tek bir formda eksprese olduğu gösterilirken, pORF2'nin 74, 82 ve 88 kD ağırlında multiple formda eksprese olduğu 164gösterildi. 82 kD'lık formun preprotein form (ppORF2) olduğu, 88 KD'luk formun ise post translasyonel modifikasyon sonucunda glikolize form olmasına karşılık, 74 kD'luk formun ise matür form olduğu gösterildi. Glikolize formun güçlü glikolizasyon inhibitörü olan tunikamisin bulunan ortamda 74 kD ağırlığında matür forma dönüşmesi 88 kD formun glikolize form olduğunu doğrulamıştır. Bu sonucun endoglikosidaz H enzimi ile tekrar eldesi gpORF2'nin mannozdan zengin yapıya sahip olduğunu ve glikolizasyonun Endoplazmik retikulumda gerçekleştiktikten sonra hücre duvarına taşındığını düşündürmüştür. pORF2'nin hücre içinde sitoplazmada ve hücre duvarında lokalize olmasına karşılık, pORF3'ün ise sitoplazma ve hücre duvarı ile birlikte az miktarda da olsa nükleus içinde bulunduğu ve post-translasyonel modifikasyona girmediği gösterildi. pORF2 ve pORF3'nin iç türdeş ilişkisi incelenmesinde pORF3 sülfidril bağlarını kırıcı kimyasal maddeye ve ısıya karşı dayanıklı bir yapı gösterirken, pORF2'nin ısı (100°C'de 2 dakika) olmadan nonkovalent homodimerik bir kompleks yapıya sahip olduğu gösterildi. pORF2 ve pORF3'ün birbirleri ile karşılıklı ilişkilerinin incelenmesinde anti- pORF2 ve anti-pORF3 antikorlar ile yapılan immünopresipitasyonda çapraz (Cross) presipitasyon gözlenmemişken, antikorların yalnızca kendi spesifik proteinlerini presipite ettiği gösterilmiştir. pORF2'nin glikolize olmasına karşılık pORF3'ün fosforile olduğu gösterdik. Amino asit diziliminde tirozin amino asidi olmadığı bilinen pORF3'ün, fosfoaminoasid analizinde `Serin` amino asidinin fosforile olduğunu gösterdik. İn-vivo ve in-vitro olarak pORF3 ekspresyonu gerçekleştirilerek yapılan fosforilasyon deneylerinde ise ORF3 fosforilasyonunun hücre içi kinazlar ve otofosforilasyon sonucunda gerçekleşmediğini tesbit ettik. 165

SUMMARY: Hepatitis E virus (HEV) has been identified as the causative agent for enteric Non-A, Non-B hepatitis. Hepatitis E virus is a responsible for a majority of sporadic and epidemic viral hepatitis in tropikal and subtropical countries. Hepatitis E virus infection is associated with increased mortality during third trimester of pregnancy. This disease is also being observed increasingly among travelers from western countries to endemic areas. There for protective vaccine is needed for HEV. There is still no detailed research on Hepatitis E infection in Turkey. Some preliminary studies were reported with conflict result. In this study, full length Open Reading Frame 2 (660 aa) and Open Reading Frame 3 (123 aa) region of HEV of Indian strain were expressed in E.Coli as N- terminal hexahistidine epitope fusions, immunoreactivity of purified protein was shown by Western Blot analysis using either anti-HEV ORF2 and anti-HEV ORF3 policlonal antibody or sera of patients with hepatitis E from Kashmir epidemics. Full length of ORF2 and ORF3 recombinant proteins were used to determine HEV infection by Western Blot analysis. The anti-ORF2 antibodies were found to be nonspecific and could not be correlated to clinical disease. pORF2 was also showed cross reactivity anti-typhii, anti-baculoviruses and anti-hepatitis B surface antigen antibodies by Western Blot analysis. The immunoglobilin M anti ORF3 was found to be specific for the presence of acute disease. Detection of HEV RNA in biological fluids and in untreated or waste water source is very important to avoid transmission of HEV via parenteral, contact and etc. as well as feco-oral route and understand the molecular epidemiology of HEV. PCR inhibitors which present into environmental samples are serious problem for detection of nucleic acids. Antigen capture and capture PCR techniques were optimized and modified for HEV detection in stools from patients with hepatitis E. These techniques eliminated all PCR inhibitors in stools and open to further for PCR automation. 166Through these studies which opened up ways to develop reliable diagnostic techniques (EIA, Western Blot, Antigen Capture and Affinity Capture-PCR) and to improve vaccine developing strategies. To understand the molecular mechanism of protection is very important to develop new vaccine or vaccine strategies against HEV. Two different vaccine studies were worked on large number of monkey model. With these two studies, efficiency of structural region proteins, pORF2 and pORF3, on protection against HEV infection were investigated. Monkeys (Maçaca Mulata) were immunized using either full length recombinant HEV structural proteins expressed in E. coli or cloned full length of HEV structural regions, ORF2 ORF3 or combined ORF2+ORF3, in pSG-1 vector `Naked DNA`. Immunization with recombinant proteins gave higher antibody titers than immunized with naked DNA Following development of high titers of anti HEV ORF2 and ORF3 antibodies, animals were challenged with infective dose of Indian strain of HEV In spite of the presence of high titers of circulating anti-HEV IgG antibodies against both these proteins in the post immunization groups, neither the ORF2 nor the ORF3 or a combination of both the `recombinant proteins` and `Naked DNA` elicited protection. HEV RNA was shown positive in sera, bile and liver by PCR. The results suggest that, neither post infection nor active immunization with structrual proteins give long term protective immunity. Expression ORF2 and ORF3 region of HEV in animal cell lines was helped to understand molecular characterization and protein-protein interactions which related virus assembly and virus host interaction. We have expressed the two structural portion of HEV genome in animal cell line (COS-1, HepG2) and in-vitro by using coupled transcription and translation system. We show that the major capsid protein, encoded by ORF2, is an 88 kD glycoprotein which is expressed intracellulary as well 167as on the cell surface and is synthesized as a precursor (ppORF2 82kD) and processed into mature form (74 kD) and which is then glycosylated (gpORF2). The glycosylated form of pORF2 was evaluated to inhibit glycosylation in transfected cells by tunicamycin. The result shows that 74 kD form a represents the nonglycosylated mature form and that 88 kD form represent glycosylated form and this result was confirmed that gpORF2 was completely reduced to nonglycosylated pORF2 form with endoglycosidase H digestion. pORF2 forms a noncovalent homodimeric complex. The minor protein, pORF3, encoded by ORF3 is a 13.5 kD nonglycosylated but phosphorylated protein and was expressed in intracellulary as well as in nuclei and does not show major processing either in animal cell or in-vitro expression system but interacts with cellular proteins. 18kD protein which called `3IP, Interacting protein` was co-precipated with pORF3 from transfected COS-1 and Huh- 7 but not HepG2 cells. Phosphoaminoacid analysis showed that `Serine` is phosphorylated aminoacid and pORF3 phosphorylation occured by neither autophosphorylation or cellular kinases. Hetoromeric interaction between pORF2 and pORF3 or combination of these two proteins were studied by transfection in COS-1 cells. The results suggest that anti-pORF2 and anti-pORF3 only were able to precipate respective proteins but not able to precipate other protein even pORF2 and pORF3 mixed and cross- immunoprecipated. 168