Pullu sazan (Cyprinus carpio L. 1758) spermasının dondurulmasında kullanılan farklı sulandırıcı ve kriyoprotektanların fertilizasyon üzerine etkisi

Abstract

Araştırmada, pullu sazan (Cyprinus carpio L. 1758) spermasının farklı sulandırıcı ve kriyoprotektan içeren sulandırma solüsyonları ile sulandırılması ve dondurulması amaçlandı. Çalışmada, 3 yaş ve üzeri 11 adet erkek ve 5 adet dişi damızlık balık kullanıldı. Balıklardan sperma abdominal masaj yöntemi ile alındı. Alınan ejekulatlarda ortalama sperma miktarı, spermatozoa motilitesi (%), spermatozoa canlılık süresi (s), spermatozoa yoğunluğu (x109 /ml) ve pH değerleri sırasıyla 14.23 ±22.16, 82 ±7.27, 575.36 ±624.63, 11.5 ± 3 x109 ve 7.7 ±0.4 olarak tespit edildi. Motilite tayininde spermatozoa aktivasyonu için % 0.3'lük NaCl solüsyonu kullanıldı. Spermanın sulandırılması için Sulandırıcı I (75 mmol/l NaCl, 70 mmol/l KCl, 2 mmol/l CaCl2, 1 mmol/l MgSO4, 20 mmol/l Tris), Sulandırıcı II (350 mM glukoz, 30 mM Tris) ve Sulandırıcı III (300 mM glukoz, %10 yumurta sarısı) olarak tanımlanan üç farklı sulandırma solüsyonu hazırlandı. Her sulandırma solüsyonuna %10 oranlarında DMSO, DMA ve Gliserol olmak üzere üç farklı kryoprotektan ilave edilerek 9 farklı sulandırıcı kriyoprotektan kompozisyonu elde edildi. Spermalar 1:3 oranında sulandırıldıktan sonra 0.25 ml'lik payetlere çekilerek sıvı azot buharında donduruldu. Dondurulan payetler sıvı azot içinde -196 °C'de saklandı. Payetlerin çözdürme işlemi 30 °C'deki su banyosunda 20 saniyede gerçekleştirildi.Gruplarda ekulibrasyon sonrası motilite oranlarının karşılaştırılmasında Sulandırıcı I ile Sulandırıcı II ve Sulandırıcı I ile Sulandırıcı III arasındaki farklılıkların önemli (P<0.001) olduğu belirlendi. Ekulibrasyon sonrası motilite oranı üzerine kriyoprotektanların etkisinin bulunduğu, Sulandırıcı I ve Sulandırıcı III e ilave edilen DMSO ile DMA (P<0.01) ve Gliserol (P<0.001) arasındaki farklılıkların önemli olduğu tespit edildi. Dondurma çözdürme sonrası spermatozoa motilitesi üzerine sulandırıcıların etkisisinin bulunduğu, Sulandırıcı I ile Sulandırıcı III arasında farklılığın önemli olduğu (P<0.05), ancak bu farklılığın oluşumunda kriyoprotektanların ya da sulandırıcı ile birlikte kriyoprotektanların etkisinin bulunmadığı gözlendi (P>0.05). Ortalama canlılık süresi en yüksek Sulandırıcı II DMSO grubunda (106.67 ±43.33 s), en düşük ise Sulandırıcı I DMA grubunda (31.66 ±9.27 s) elde edildi. Ancak, spermatozoa canlılık süreleri açısından gruplar arasında farklılığın önemli olmadığı tespit edildi (P>0.05). Tüm gruplarda fertilizasyon oranları oldukça yüksek olmasına karşın, Sulandırıcı I ile Sulandırıcı II ve Sulandırıcı I ile Sulandırıcı III arasında farklılıkların önemli olduğu gözlendi (P<0.01). Ancak bu farklılığın oluşumunda kriyoprotektanların ya da sulandırıcı ile birlikte kriyoprotektanların etkisinin bulunmadığı gözlendi (P>0.05).Sonuç olarak, üç farklı sulandırıcı ve kriyoprotektan içeren sulandırma solüsyonları ile sulandırılıp dondurulan pullu sazan sperması ile yapılan fertilizasyon işlemlerinde tüm deneme gruplarında fertilizasyon oranı oldukça yüksekdi. En yüksek fertilizasyon oranı sulandırıcı II DMA grubunda (99.66 ±0.33), en düşük fertilizasyon oranı ise sulandırıcı I DMSO grubunda (96.00 ±1.00) elde edildi.

In this study, it was aimed to dilute and freeze the semen of scaly carp (Cyprinus carpio L.1758) in different cryoprotectants and extenders. In the experiment, 11 male and 5 female over 3-years-old stud carps were used. The semen of the fishes was collected by the method of abdominal massage. The mean semen volume (ml), sperm motility (%), sperm viability time (sec), spermatozoa concentration (x109 / ml) and pH values were 14:23 ±22.16, 82 ±7.27, 575.36 ±624.63, 11.5 ±3 x109 and 7.7 ±0.4, respectively. In order to activation of sperm, 0.3% NaCl the solution was used. For semen dilution three different diluents called as extender I (75 mmol/l NaCl, 70 mmol/l KCl, 2 mmol/l CaCl2, 1 mmol/l MgSO4, 20 mmol/l Tris), II (350 mM glucose, 30 mM Tris) and III (300 mM glucose, %10 egg yolk) were used. DMSO (10 %), DMA (10 %) and glycerol (10 %) were added to each extender separately, in which nine different extender-cryoprotectant compositions were obtained. After the dilution of sperm at 1:3 ratio, the sperm samples were transferred in 0.25 ml plastic straws (IMV, France). The straws were cryopreserved in liquid nitrogen vapor (-120 °C) and then was stored in the liquid nitrogen (-196 °C). The frozen straws were thawed in a water bath at 30 ºC for 20 sec.According to the comparison of motility rates in the groups after equilibration rates, it was found that extender I was significantly (P<0.001) different from extender II and III. After equilibration, the effects of cryoprotectants on the motility rate was observed and it was found that the difference between DMA and glycerol with DMSO added to extender I and III was significant (P<0.01). It was observed that there was an effect of extenders on the motility of spermatozoa after the thawing of straws. In addition, there was a significant difference between the extender I and III (P <0.05). However, it was found that this difference was not the result of the use of cryoprotectants or extender with cryoprotectants (P> 0.05). After the straws were thawed, average lifetime was the highest in the extender II DMSO group (106.67 ±43.33 sec), and lowest in the extender I DMA group (31.66 ± 9.27 sec). However, in terms of viability of spermatozoa differences between groups were not observed (P>0.05). Although fertilization rates were high in all groups, the extender I was found to be the significant different (P<0.01) from the extender II and III. However, it was observed that cryoprotectants or extenders with cryoprotectants (P>0.05) did not have any effect on the formation of this difference.In conclusion, fertilization rates were considerably high in all experiment groups in which the semen of Cyprinus carpio (L.1758) were cryopreserved in liquid nitrogen vapor after diluting with three different extender-cryoprotectant compositions. Fertilization rate was the highest in the extender II DMA group (99.66 ±0.33), and lowest in the extender I DMSO group (96.00 ±1.00).