İncir mozaik hastalığı etmenlerinin tanılanması ve genomik karakterizasyonu

Abstract

araştırılması, etmenlerinin tanı ve karakterizasyonu, hastalık etmeninin taşıma denemeleri ve konukçu dizilerinin belirlenmesi ile tüm genomu tanımlanmış olan Fig mosaic virus' un genetik çeşitliliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Arazi koşullarında gözlemler alındıktan sonra tanı ve karakterizasyon amaçlı elektron mikroskobisi ve moleküler teknikler kullanılmıştır. Elektron mikroskobunda, örneklerin çoğunda çift membranlı yapılar tespit edilmiştir. Yapılan RT-PCR analizleri sonucunda testlenen 101 incir örneğinin 94' ü FBV-1; 78' i FMV; 1' i FLMaV-1; 14' ü FLV-1; 2' si FMMaV ve 5' i AFCV-1 ile enfekteli bulunmuştur. FLMaV-2, AFCV-2, SCFaV, CMoMV ve CRLaRNA ile enfekteli örnek tespit edilmemiştir. Nükleotid dizi analizi sonucu elde edilen verilerin BLAST analizleri sonuçlarına göre; FLMaV1, FMV, FLV-1 ve FMMaV izolatları ile örneklerimiz yüksek oranda benzerlik göstermektedir. FBV-1, AFCV-1' in gen bankasında kayıt bilgileri bulunmadığından eşleşme yapılamamıştır. Şiddetli simptom gösterip, tanımlanmış virüslere karşı pozitif sonuç vermeyen örnekler genomik dizilemeye alınmıştır. Genomik dizileme için dsRNA izolasyonları, cDNA sentezlemesi, DOP-PCR, klonlama ve DNA dizileme yapılmıştır. dsRNA analizlerinde değişik seviyelerde çeşitli bantlar elde edilmiş ve bu bantların değişik virüs grupları ya da parçalı genoma sahip virüse ait olabileceği varsayılarak klonlama çalışmaları planlanmıştır. Genomik dizileme analizleri sonucunda elde edilen diziler BLASTn ve BLASTx analizleri ile değerlendirilmiştir. Analizler sonucunda kısmi FMV ve FLMaV2 dizileri elde edilmiştir. FMV probları kullanılarak yapılan Northern hibridizasyon, sonuçları ile FMV varlığı doğrulanmıştır.Hastalıktan sorumlu olası etmenlerin deneysel taşıma denemelerinde enfekteli incir ağaçlarından toplanan Aceria ficus Cotte, sağlıklı indikatör bitkilere aktarılmıştır. Taşıma denemeleri sonunda, incir fidelerinde değişik simptomlar belirmiş ve ilk kez bu çalışma ile FMV' nin aktarımında eriyofidlerin önemli bir rolü olduğu kanıtlanmıştır. Konukçu dizilerinin tespit edilmesi amacı ile yapılan taşıma denemeleri sonucunda, incir fideleri dışında Cezayir menekşesi bitkisinin de mozaik simptomları gösterdiği tespit edilmiştir. İnokule edilen bitkilerin elektron mikroskobisi sonucunda, çift membranlı yapılar dışında Closteroviridae benzeri partiküller gözlenmiştir. Yapılan RT-PCR çalışmaları sonucunda, inokule edilen incir ve Cezayir menekşesi bitkilerinin FMV ve FBV-1 ile enfekteli olduğu tespit edilmiştir. Eriyofid bünyesindeki virüsün tespiti amacı ile yapılan RT-PCR çalışmalarında FMV tespit edilmiştir.FMV' nin genetik çeşitliliğinin tespiti için nükleoprotein ve glikoprotein bölgelerine spesifik primerler kullanılarak RT-PCR yapılmış, PCR ürünleri klonlanmış ve dizilenmiştir. Filogenetik analizler sonucunda glikoprotein bölgesinin nükleoprotein bölgesine göre daha değişken olduğu tespit edilmiştir.

The aim of this study, was to perform a survey of fig mosaic disease agents, to identify and characterize the causal agents, to perform transmission experiments and to determine the host range and genetic diversity among Fig mosaic virus isolates. After survey analysis, electron microscopy and molecular techniques were used for identification and characterization. Double membrane bodies were found in most of the samples. According to RT-PCR analysis, 94 FBV-1; 78 FMV; 1 FLMaV-1; 14 FLV-1; 2 FMMaV and 5 AFCV-1 infections were found in a total of 101 samples. FLMaV-2, AFCV-2, SCFaV, CMoMV and CRLaRNA infections were not found. The tested samples were found to be highly similar to FLMaV1, FMV, FLV-1 and FMMaV isolates according to BLAST analysis of nucleotide sequences which are recorded in Genbank. Because FBV-1 and AFCV-1 are not yet found in Genbank, results could not be compared with them. The samples, which showed severe symptoms and were not infected with known virus, were analyzed with genomic sequencing approach. dsRNA isolation, cDNA synthesis, DOP-PCR, cloning and sequencing were done for this analysis. Different sized bands were obtained with dsRNA analysis and the bands, which were assumed to be specific for different viruses or belonging to a multipartitated virus genome, were cloned. The sequences which were obtained from genomic sequencing, were analyzed with BLASTn and BLASTx. Partial FMV and FLMaV2 sequences were found as a result of the analysis. Northern hybridization with FMV probes confirmed the presence of FMV.For the experiments about vector transmission of causal agents of FMD, Aceria ficus Cotte, were collected from infected fig samples and were transferred to healty indicator plants. According to vector transmission results, various symptoms were observed on the fig seedlings and it was proven for the first time that eriophydes have an important role in the transmission of FMV. Vector transmission experiments for the determination of host range of the disease showed that, in addition to fig, periwinkle had mosaic symptoms. Electron microscopy of the inoculated plants showed Closteroviridae like particles and double membrane bodies. According to RT-PCR analysis, inoculated periwinkle and fig plants were infected with FMV and FBV-1. FMV was determined to be inside the mites based on RT-PCR analysis.RT-PCR analysis were done with nucleoprotein and glycoprotein specific primers of FMV for determination of genetic diversity among the FMV isolates. PCR products were cloned and sequenced. According to phylogenetic analysis, glycoprotein region had more variation than nucleoprotein region.