Halofilik arke kaynaklı amilaz enziminin saflaştırılması

Abstract

Bu çalışmada ekstraselüler halofilik arke kaynaklı amilaz enziminin izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla kullanılacak ekstraselüler halofilik arke izolatının seçimi amilaz aktivitesine göre yapılmıştır. Amilaz enziminin saflaştırılmasında sırasıyla diyaliz, konsantratör ile deriştirme, kalsiyum alginatla biyoseçimli izolasyon ve DEAE-Sefadeks iyon değiştirici kromatografisi teknikleri kullanılmıştır. Amilaz enzimi, kalsiyum alginat ile kısmen izole edildiğinde spesifik aktivite 5.115 U/mg protein olarak bulunmuş ve bu aşamada enzim 77.5 kat saflaştırılmıştır. DEAE-Sefadeks iyon değiştirici kromatografisi ile yapılan bir sonraki saflaştırma basamağında ise amilaz enziminin spesifik aktivitesi 10.00 U/mg prot. olarak bulunmuş ve enzim bu basamakta 151.52 kat saflaştırılmıştır. Çalışmada saflaştırılmış halofilik arke kaynaklı amilaz enziminin en yüksek aktivite gösterdiği pH, sıcaklık ve NaCl derişimleri belirlenerek karakterizasyonu da yapılmıştır. Buna göre seçilen A-235 izolatından elde edilen amilaz enziminin optimum pH, sıcaklık ve NaCl derişimi sırasıyla pH 5, 50 ºC ve 3 M NaCl olarak belirlenmiştir. Bu koşullarda farklı derişimdeki nişasta derişimlerine bağlı olarak aktiviteler belirlendiğinde Km ve Vmax değerleri ise Lineweaver-Burk denklemine göre sırasıyla 4.1 mg nişasta/mL ve 0.42 mg nişasta/dk.mL olarak hesaplanmıştır.

In this study, isolation and characterization of extracellular halophilic archaeal amylase enzyme was carried out. Halophilic archaeal starin was selected according to amylase activity. Dialisis, concentrating by concentrator, bioselective participitation by calcium alginate and DEAE-Sephadex ion exchange choromatography methods were used in sequence. Amylase enzyme was partially isolated by calcium alginate with 5.115 U/mg starch as specific activity, and enzyme was 77.5 fold purified at this stage. In subsequent purification step by DEAE-Sephadex ion exchange choromatography, spesific activity was found as 10.00 U/mg protein and amylase was purified 151.52 fold. Purified amylase enzyme was characterized by determination optimal pH, temperature and NaCl concentraion of A-235 strain were pH 5, 50 ºC and 3 M, respectively. When amylase activities were determined at optimal conditions, Km and Vmax values were calculated as 4.1 mg starch/ mL and 0.42 mg starch/min.mL according to Lineweaver-Burk Plot.