Farklı embriyo dondurma yöntemlerinin, embriyonik kök hücre belirteçlerinden NANOG, OCT4, SOX2 VE SSEA4 ekspresyonu üzerine etkileri

Abstract

Çalışmamızda; blastosist safhasındaki embriyoların klasik vitrifikasyon ve katı yüzey dondurma tekniği (SSV)yöntemleri ile dondurularak çözülmesinin ardından canlılık oranları ile embriyonik kök hücre belirteçlerinden Nanog, Oct4, Sox2 ve SSEA4 ekspresyonları açısından karşılaştırılmalı olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. B6C3F1 (C57BL/6J X C3H/HeN) dişi farelerden elde edilen pronükleer safhada (PN) embriyolar blastosist safhasına kadar kültüre edilmiştir. Bu embriyolardan 3 deney grubu (kontrol- SSV-vitrifikasyon) oluşturulmuştur. Dondurup çözme işleminin ardından 3 deney grubundaki blastosistler; morfolojik özellikleri ve embriyonik kök hücre belirteçlerinden Nanog, Oct4, Sox2, SSEA-4 ekspresyonları açısından değerlendirilmiştir. Embriyoların morfolojileri; faz kontrast mikroskopta incelenmiştir. Embriyonik kök hücre belirteçlerinin lokalizasyonu konfokal mikroskoplar kullanılarak araştırılmıştır. Zenn görüntü analiz programı ile belirteçlerdeki değişim sayısal olarak analiz edilmiştir. Tüm sonuçların istatistiksel değerlendirilmesi SPSS 20.0 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. SSV dondurma yöntemi ile dondurulup çözündürülen 68 adet blastosistin 49 adedi (%72), klasik vitrifikasyon dondurma yöntemi kullanılarak dondurulup çözündürülen 71 adet blastosistten 48 adedi (%68) canlılığını sürdürmüştür. Blastosistlerin dondurulmasında uygulanan SSV yönteminin, klasik vitrifikasyon yöntemine göre, çözündürme sonrası canlılık açısından daha avantajlı bir yöntem olduğu gözlemlenmiştir. Embriyonik kök hücre belirteçlerinden olan; Nanog, Oct4, Sox2 ve SSEA4 ekspresyon düzeyleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında; SSV ve klasik vitrifikasyon gruplarında azalma olduğu görülmüştür. Ekspresyondaki azalma her dört kök hücre belirteci için ayrı ayrı incelendiğinde; klasik vitrifikasyon grubunda azalmanın daha belirgin olduğu dikkati çekmiştir. Nanog ve Sox2 ekspresyonu değerlendirildiğinde kontrol grubundan, klasik vitrifikasyon grubuna doğru ortalamalarda azalış gözlenmiştir;ancak kontrol ve SSV grupları arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır. Tüm kök hücre belirteçleri içerisinde; dondurup çözme işleminin ardından her iki grupta da en fazla etkilenen belirtecin SSEA-4 olduğu görülmüştür. Tüm bu sonuçlar; SSV tekniğinin de klasik vitrifikasyon yöntemine alternatif bir metod olarak düşünülmesi gerektiğini göstermektedir. Bu yöntemin klinikte hastalarda kullanımının tartışılabilmesi için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

The current study aims comparative examination of the effects of classical vitrification and SSV techniques on the expression of main stem cell markers, Nanog, Oct4, Sox2 and SSEA4, on blastocysts. Embryos at pronuclear (PN) stage were extracted from female B6C3F1 (C57BL/6J X C3H/HeN) mice. Those embryos were cultured until blastocyst stage. Healthy blastocysts were divided into three experimental groups : Control, SSV and classical vitrification groups. After freeze and thaw process; all embryos were examined under phase contrast microscope. Then, they were labeled with the antibodies specific for Nanog, Oct4, Sox2 or SSEA-4. Zenn image analysis ssytem was used for examination of the results. Statistical analysis was done by using SPSS 20.0. 49 out of 68 embryos (%72) were survived in SSV groups after thawing; while 48 out of 71 embryos (%68) exsisted after classical vitrification. Survival of the embryos after SSV group was higher than the classical vitrifiaction group. Nanog, Oct4, Sox2 ve SSEA4 expression were lowered when compared with the control. Only change at Nanog and Sox2 levels were not statistical meaningful. The most change was seen in the embryos labeled with SSEA4. Those results show that SSV method should also be considered as an alternative technique to the classical vitrification method. Further studies are needed to analyse if this method can also be used in clinics for therapy.