Recombinant antigen and monoclonal antibody production for katanin P60

Abstract

Mikrotübülleri kesen proteinlerden biri olan katanin, p60 ve p80 olarak tanımlanan iki alt üniteden oluşan bir heterodimerdir. p60 alt ünitesi mikrotübülün kafesini kırmak için ATP yi hidrolizleyen bir enzim iken, p80 alt ünitesi p60'ın aktivitesini düzenler ve sentrozoma lokalize eder. p60'ın kesim aktivitesi hücre bölünmelerinde ve postmitotik nöronların aksonal büyümesinde kritik rollere sahiptir. Katanin ayrıca, nöritlerin uzunluk, sayı ve dallanma modelleri gibi nöronal morfolojinin çeşitli durumlarında fonksiyon gösterebilmektedir. Katanin proteini şu ana kadar çok fazla çalışılmış olmasına rağmen, etkileştiği proteinler çok iyi anlaşılamamıştır. Monospesifik antikorlar, hücresel kataninin görüntülenmesi ve etkileşen proteinlerinin belirlenmesinde yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu çalışmada, tam katanin p60 proteininden özellikliği, çözünebilirliği ve antijenik determinant içeriği göz önünde bulundurularak bir amino asit dizisi seçildi ve verimli bir anlatım sisteminde anlatımı yapıldı. Sonra, 6-8 haftalık Balb/c türü fareler saflaştırılmış rekombinant katanin p60 proteini ile bağışıklandırıldı. Yüksek bağışık cevabı olan fare üzerinde hibridoma teknolojisi kullanılarak füzyon çalışmaları polietilenglikol varlığında gerçekleştirildi. ELISA (Enzim Bağlantılı Immuno Sorbent Ölçümü) kross reaktivite test sonuçları, 295 melez klon arasından katanin p60' a karşı spesifik monoklonal antikor üretmeye aday bir melez klon, elde edildiğini göstermiştir. ELISA ve hibridoma alt izotipleme testlerine göre, bu monoklonal antikorun alt tipi IgM olarak belirlenmiştir.

Katanin, one of the proteins that severs microtubules, is heterodimer composed of two subunits termed p60 and p80. The p60 subunit is an enzyme that hydrolyzes ATP to break the lattice of the microtubule, whereas the p80 subunit regulates the activity of p60 and localizes it to the centrosomes. Severing activity of katanin p60 has critical roles in cell divisions and in axonal growth in postmitotic neurons. Katanin may also function in various aspects of neuronal morphology such as length, number and branching patterns of neuritis. Although, katanin has been extensively studied, interacting proteins of katanin p60 are not well understood. Monospecific antibodies could be helpful to monitor cellular katanin and find out its interacting proteins. Therefore, in this study, an amino acid sequence was selected from full katanin p60 protein considering specificity, solubility and inclusion of antigenic determinants of the protein and expressed efficiently. 6-8 weeks old Balb/c mice were then immunized with purified recombinant katanin p60 protein. Fusion study was carried out by using hybridoma technology with a mouse having high immune response in the presence of polyethylenglycol. ELISA (Enzyme Link Immuno Sorbent Assay) cross reactivity test results showed that one hybrid clone was obtained among 295 hybrid clone as a candidate for producing a specific monoclonal antibody against katanin p60. According to ELISA and mouse monoclonal antibody isotyping tests results, IgM was found as the subtype of this monoclonal antibody.