Identification of AbrB and Spo0A binding sites on B. subtilis yvfI promoter

Abstract

Basilisin, N ucunda L-alanine ve C ucunda doğal olmayan bir aminoasit olan L-anticapsine bulunduran iki aminoasitten oluşan bir dipeptidtir. Basilisinin biyosentezi, daha sonra bacABCDE olarak adlandırılan ywfBCDEF gen kümesi tarafından gerçekleşmektedir. Sonraki çalışmalarda, bacABC genlerinin antikapsin üretiminden sorumlu olduğu, bacD ve bacE genlerinin ise sırasıyla amino asid ligasyonu ve basilisine karşı korunma fonksiyonlarını gerçekleştirdiği kanıtlanmıştır.AbrB, Spo0A, ScoC ve Cody proteinleri düzenleyici protein sınıfının önemli üyelerinden birkaçıdır. AbrB ve Spo0A geçiş-düzenleyici proteinlerinin Basillus türlerinde antibiyotik ve toksin biyosentezinde önemli görevleri olduğu kesin olarak bilinmektedir. Basilisinin de abrB ve spo0A genleri tarafından regule edildiği gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan Tn10 mutagenesis çalışmaları, transkripsiyonel düzenleyiciye benzeyen yvfI geninin (GntR ailesi) basilisin biyosenteziyle ilgisi olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, yvfI geninin basilisin üretiminden sorumlu olması nedeniyle, yvfI geninin düzenlenmesinde görev alan herhangi bir gen dolaylı olarak basilin üretiminden de sorumludur. Yukardaki çıkarımdan hareketle, DBTBS veritabanı kullanılarak yvfI geninin promoter dizisi, aday düzenleyici proteinlerin bağlanabileceği cis-elementlerinin bulunması için incelendi, ve AbrB ile Spo0A düzenleyici proteinleri için olası bağlanma bölgeleri bulundu. Elektromobility shift deneyi ile AbrB ve Spo0A proteinlerinin yvfI promoter dizisine bağlandıkları bulunduktan sonra, söz konusu düzenleyici proteinlerin yvfI promoter dizisinde bağlandıkları bölgeleri açığa çıkarmak için DNase I footprinting deneyi gerçekleştirildi. GeneMapper programı kullanılarak düzenlenen electrophoregramlar incelendi ve her bir düzenleyici protein için yvfI promoter dizisi üzerinde bir bağlanma bölgesi bulundu. Elde edilen sonuçlar, AbrB ve Spo0A düzenleyici proteinlerinin, basilisin üretimini yvfI geninin ekspresyonunu transkripsiyon düzeyinde değiştirerek düzenlediklerini açığa çıkarmıştır.

Bacilysin is a dipeptide containing L-alanine at its N-terminal and the unusual amino acid L-anticapsine at its C terminal. The biosynthesis of the dipeptide bacilysin depends on the ywfBCDEF gene cluster which was renamed as bacABCDE. While bacABC genes carry the anticapsin synthesis function, the bacD and bacE genes encode for the function of amino acid ligation and self-protection to bacilysin, respectively.It is undoubtedly known that transition state regulator proteins, AbrB and Spo0A have crucial roles in the biosynthesis of antibiotics in Bacillus species. Bacilysin is also under the regulation of abrB and spo0A genes. Very recently, yvfI gene which is similar to transcriptional regulator (GntR family) was found responsible in bacilysin production. Since yvfI gene is essential for the bacilysin biosynthesis, any gene involved in the regulation of yvfI were considered as candidates in the regulation of bacilysin production indirectly. In this study, yvfI gene promoter by DBTBS database was examined putative binding sites for AbrB and Spo0A was found regulatory proteins. AbrB and Spo0A proteins were tested for their abilities to bind the yvfI promoter DNA in electromobility shift experiment. Furthermore, DNase I footprinting of the yvfI promoter was applied in order to discover the exact regions occupied by AbrB and Spo0A trans-acting regulatory factors. By using GeneMapper software, binding sites for each regulatory protein on yvfI promoter were determined. Data obtained in this study suggested that AbrB and Spo0A regulatory proteins have roles in the bacilysin biosynthesis by regulating yvfI gene expression on transcriptional level.