Construction of GFP based designer proteins

Abstract

Nanoteknolojik uygulamalarda, peptit ve proteinlerle ilgili malzemeler akıllıyapıta?ları olarak kullanılırlar. Doğada moleküler tanımaya dayalı i?levler evrimdeanahtar bir rol alırlar, ardı?ık mutasyon ve seçilim döngüleri iyile?tirilmi? neslin birparçasıdır. Doğada proteinlerin anorganiklerin olu?umunu ve morfolojisini kontrolettiği pek çok i?levsel biyolojik malzeme ve sistem örneği vardır.Son yıllarda, yalnızca sert doku mühendisliğinde değil, aynı zamanda ileri malzemeve sistemlerin üretiminde, anorganiklerin biyolojik yolla biyobenzetimsel sentez veolu?umu oldukça ilgi çekmektedir. Bu çalı?mada, genetik mühendisliği ileiyile?tirilmi? proteinlerin malzemenin etiketlenmesi ve kurulumu için biyolojikyollara yönelmeye odaklandık. Anorganik malzemeyi özgül olarak hedefleyen vebiyolojik fonksiyonlarını hala sürdüren multifonksiyonel proteinler tasarladık.Burada, genetik mühendisliği uygulanmı? ye?il floresan proteinlerinin tasarlamasıyla,kalsiyum fosfat mineral ve metal yüzey/nanopartikül etkile?imlerine dayalı iki farklıdurum çalı?ması seçtik.Kalsiyum fosfat bazlı biyomineralizasyon, kemik ve di? sert dokularınınolu?umundaki anahtar rolü nedeniyle yaygın olarak çalı?ılmı?tır. Bu nedenle,kalsiyum fosfat minerallerini hedefleyen ve biyomineralizasyonun görüntülenmesinimümkün kılan protein bazlı bir sistemi yani GFPuv-HABP'yi tasarladık. Çiftfonksiyonlu proteinlerin floresan ve bağlanma aktiviteleri, sırasıyla floresanmikroskopi ve spektroskopi ile kuartz kristal mikrobalans sistemi kullanılarakkarakterize edilmi?tir. GFPuv-HABP1 füzyon proteinin kullanımı, zamansalmineralizasyonu izleme ve mineralle?en dokuların görüntülenmesi açısındandeğerlendirilmi?tir.Biyoteknolojide, bölgeye özgül protein immobilizasyonu protein çipleri,biyosensörler ve mikroarrayler gibi etkin araçların üretiminde gereklidir. Fiziksel vekimyasal immobilizasyonu kapsayan geleneksel yöntemlerin, proteinimmobilizasyonu için de uygulanabilirliği vardır. Ancak, bu yakla?ımlar, proteininfonsiyonel gurupları ile yüzey arasındaki etkile?imleri izleyen kontolsüz toplanmasebebiyle protein aktivitesinde dü?ü?e neden olabilir. Burada, anorganiklere bağlananpeptidlerin, fonksiyonel protein GFPuvnin düz yüzey ya da nanopartikül ?eklindefarklı formlardaki gümü? ve altın substrata immobilizasyonunda kullanılmasında,peptit bazlı kurulumdan faydalanılmı?tır. Bifonksiyonel proteinlerin nanopartiküllerebağlanması ve floresan sönüm/artma etkinliği arasındaki korelasyondeğerlendirilmi?tir.Son olarak, genetik mühendisliği ile iyile?tirilmi? anorganiklere bağlanan peptitlerin(GEPI) fonksiyonel proteinlere yerle?tirilebileceğini, GEPI-GFP'nin kontrollübiçimde, minerallerin etiketlenmesinden floresan sönme aktivitesine kadar çe?itlialanlarda kullanılabileceğini gösterdik.

In nanotechnological applications, peptide and protein related materials are exploitedas smart building blocks. In nature, molecular recognition based functions are a keyrole in evolution, sequential cycles of mutation and selection are part of improvedprogeny. In nature there are various examples of functional biological materials andsystems that proteins control the formation and the morphology of inorganics.In recent years, not only in hard tissue engineering but also in producing advancematerials and systems, biomimetic synthesis and formation of inorganics usingbiological routes have attracted a great interest. In this study, we focus on addressingbiological routes for materials labelling and assembly using genetically engineeredproteins. We designed multifunctional proteins that can target inorganic materialsspecifically and still carry their biological functionality. Here, we selected twodifferent case study based on calcium phosphate mineral, and metal surface/NPinteractions through designing engineered green fluorescence proteins.Calcium phosphate based biomineralization is studied extensively due to its key rolein the bone and dental hard tissue formation. We therefore, designed a protein basedsystem that can target calcium phosphate minerals and allows monitoring ofbiomineralization, namely GFPuv-HABP. Fluorescence and binding activities of bifunctionalproteins were characterized using fluorescence microscopy andspectroscopy, and quartz crystal microbalance system, respectively. The utility ofGFPuv-HABP1 fusion protein was assessed for both time-wise mineralizationmonitoring and visualization of mineralized tissues.In biotechnology, site-specific protein immobilization is required for the fabricationof efficient tools such as protein chips, biosensors and microarrays. The conventionalmethods, including physical and chemical immobilizations are also applicable forprotein immobilization. However, these approaches may cause a decrease in proteinactivity due to the uncontrolled assembly following interaction between functionalgroups of the protein and the surface. Here we employed peptide based assemblywhere inorganic binding peptides were used for the directed immobilization of afunctional protein GFPuv on silver and gold substrates with different forms, as flatsurfaces and nanoaprticles. The correlation between the binding of bifunctionalproteins to nanoparticles and fluorescence quenching/enhancement efficiency wasevaluated.Finally, we demonstrated that genetically engineered peptides for inorganics (GEPI)can be inserted into functional proteins and GEPI-GFP can be used in diverse areasfrom labelling minerals to quenching flurorescence activity in a controlled manner.