Immobilization of lipase from candida rugosa on hydrophobic and hydrophilic supports

Abstract

öz Bu çalışmada, Candida rugosa' dan elde edilmiş lipaz enziminin hidrofobik ve hidrofilik desteklere immobilizasyonu sırasında, en yüksek immobilize olan enzim oranının ve immobilize enzim aktivitesinin elde edilebileceği çalışma koşullan ve desteğin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, immobilizasyon denemelerinden önce serbest enzim için en uygun çalışma koşullan araştınlmıştır. Candida rugosa'dm elde edilen lipaz enziminin aktivitesinin pH değeri 6.5 olan ve 1.0 M NaCl içeren fosfat çözeltisi içinde ve 30 °C inkübasyon sıcaklığında en yüksek değere çıktığı görülmüştür. Aynca, 4 ile 37 °C arasında enzim aktivitesinde belirgin bir değişim olmadığı da gözlenmiştir. Belirtilen koşullarda serbest enzimin aktivitesinin 12.2 U/mg enzim olduğu ve enzimin belirtilen koşullarda aktivitesini 24 saat boyunca koruduğu saptanmıştır. Tüm immobilizasyon denemeleri sabit sıcaklık ve kanştırma hızında gerçekleştirilmiştir. Lipaz enziminin hidrofobik yapıdaki oktil-sefaroz desteğine 10 dakika gibi kısa bir sürede, çok hızlı bir şekilde bağlandığı belirlenmiştir. İmmobilizasyon ortamında pH değeri 7.0 olan fosfat çözeltisi ile 1.0 M NaCl bulunduğunda ve ortam sıcaklığı 37 °C olduğunda immobilize olan enzim oranının en yüksek seviyeye çıktığı görülmüştür. Aynca, katı-sıvı oranının 0. 1 olmasının yani 1 mi desteğe 9 mi enzim çözeltisi katılmasının en uygun sonucu verdiği belirlenmiştir. Enzim miktannın immobilizasyon üzerine etkisi iki farklı sıcaklıkta araştınlmıştır. 20 °C'de yapılan denemede, çalışılan konsantrasyon aralığında deney verilerinin lineer izoterme uyduğu görülmüş ve C sabiti 138.2 olarak hesaplanmıştır. 4 °C'de yapılan deneme de benzer sonuçlar vermiş ve lineer izoterme uyum sağlamıştır. Bu sıcaklıktaki C değeri ise 209.1 olarak saptanmıştır. Bu koşullar altında immobilize enzimin aktivitesi 410 U/ml destek olarak hesaplanmıştır. Lipazm hidrofilik yapıda olan kitosana immobilizasyon sırasında ise, reaksiyonun çok daha geç dengeye geldiği görülmüştür. Bu durumda immobilizasyon işlemi 24 saat devam etmektedir. İmmobilizasyon ortamının pH değerinin 6.5 olması ve ortam sıcaklığının 37 °C olması durumunda immobilize olan enzim oranının en yüksek seviyeye çıktığı görülmüştür. Fakat, bu denemelerde ortamda tuz bulunmamasının immobilizasyon üzerinde olumlu bir etkisi olduğu gözlenmiştir. Aynca, hidrofobik destekte olduğu gibi, katı-sıvı oranının 0.1 olmasının yani 1 mi desteğe 9 mi enzimçözeltisi katılmasının en uygun derişim olduğu tayin edilmiştir. Enzim miktarının immobilizasyon üzerindeki etkilerinin incelendiği denemelerde ise verilerin Langmuir izotermi 'ne uyduğu görülmüş ve sabit değerler qm=200 U immobilize enzim/ml destek ve K= 72.5 U /mi çözelti olarak saptanmıştır. Kitosana immobilize olmuş lipazın buzdolabı sıcaklığında (4 °C) dayanımı iki farklı koşulda araştırılmıştır, immobilize enzimin kuru ortamda bekletilmesi durumunda, 25 günlük bir süreçte aktivitesini % 50 oranında kaybettiği görülmüştür. Fakat, aynı enzimin pH değeri 6.5 olan fosfat çözeltisi içinde bekletilmesi durumunda 2 aylık bir süreçte aktivite kaybının sadece % 10 oranında olduğu tespit edilmiştir. Bunlara ilave olarak, serbest ve immobilize lipaz enziminin farklı substratlara karşı davranışını gözlemlemek için ek bir çalışma yapılmıştır. Sonuç olarak, hidroliz ortamında.% 33 oranında zeytinyağının substrat olarak kullanılmasının serbest enzimin en yüksek aktiviteyi göstermesini sağladığı görülmüştür. Kitosan'a immobilize olmuş lipaz enzimi için ise hidroliz ortamında % 45.5 oranında mısır özü yağı bulunması gerektiği gözlenmiştir.

ABSTRACT The aim of this study is to find the optimum conditions for the immobilization of Candida rugosa lipase and also to select the most suitable support maximizing the immobilized enzyme yield under these optimum conditions. Prior to the immobilization studies, optimum working conditions of soluble Candida rugosa lipase were investigated. Candida rugosa lipase expressed maximum activity in pH 6.5 phosphate buffer with 1.0 M NaCl solution at 30 °C. Indeed, lipase was fully active between 4 and 37 °C. Under these conditions, activity of free lipase was 12.2 U/mg enzyme. Immobilization studies were carried out under constant temperature and stirring rate. Immobilization of lipase on hydrophobic support, octyl-sepharose, was very rapid and the equilibrium was reached in 10 minutes. Immobilized enzyme ratio was maximized by the use of pH 7.0 phosphate buffer with 1.0 M NaCl at 37 °C. Also, optimum solid-liquid ratio was found to be 0.1 when 1 ml support was added to 9 ml of enzyme solution. Effect of enzyme loading on lipase immobilization on octyl-sepharose was investigated at two different temperatures. At 20 °C and in the specified range of enzyme concentration (0.25-75 mg/ml), the experimental data fitted well to the linear isotherms with a C value of 138.2. Also, at 4 °C, results were similar and the experimental data could be expressed with the linear isotherm with a C value of 209.1. Under these conditions, activity of immobilized enzyme was 410 U/ml hydrated support. In the case of immobilization on hydrophilic support, chitosan, the reaction was much slower and the amount of the immobilized enzyme was maximized at the end of 24th hour. Optimum conditions of immobilization were determined as pH 6.5 and 20 °C. In this case, addition of salt decreased the immobilization and, therefore, low ionic strengths favored immobilization. Again, optimum solid-liquid ratio was found to be around 0.1 when the 1 ml support was added to 9 ml. of enzyme solution. The effect of enzyme loading was investigated at 20 °C and in the specified range of concentration, data fitted well to the Langmuir isotherm where the constants were calculated to be qm=200 U adsorbed enzyme/ml hydrated support and K= 72.5 U/ml solution. The storage stability of chitosan immobilized lipase was investigated at 4 °C under two different conditions. When immobilized lipase was kept dry for 25 days,50 % of the initial activity remained. However, if the same lipase was kept in phosphate buffer of pH 6.5, activity loss was only 10 % after a period of 2 months. Complementary work was also carried out to find the differences in the behavior of free and chitosan immobilized lipase against different substrates. The results showed that the presence of 33 % olive oil and 45.5 % corn oil in substrate yielded the maximum activity for free and chitosan immobilized lipases, respectively.