Genotypic characterization of extracellular enzyme producing thermophilic bacteria in Balçova geothermal region

Abstract

oz Termofiller, yüksek sıcaklıklarda yaşamaya adapte olmuş organizmalardır. Termofillerden elde edilen enzimler, yüksek sıcaklıklarda gösterdikleri aktivite ve stabilite nedeniyle birçok ticari uygulamalarda kullanılmaktadırlar. Bu sebeple, termofilik bakterilerin doğal kaynaklardan izole edilmeleri ve tanımlanmaları yeni endüstriyel enzimlerin keşfedilmesi açısından önemlidir. Bu açıdan bakıldığında, Balçova Jeotermal Bölgesi endüstriyel olarak önemli özellikleri olan termofilik mikroorganizmalar için iyi bir kaynak oluşturmaktadır. Bu çalışmada Balçova Jeotermal Bölgesinden endüstriyel olarak önemli ekstraselüler enzim üreten termofilik bakterilerin izolasyonu ve genetik yöntemlerle tanımlanması amaçlanmıştır. Bu kapsamda, 16S-ITS rDNA RFLP, plazmid profillerinin belirlenmesi ve 'pulsed field' jel elektroforezi (PFGE) çalışmaları yapılmıştır. Balçova Jeotermal Bölgesinden sağlanan çeşitli örneklerden 112 adet termofilik suş izole edilmiştir. İzolatlar 6 adet ekstraselüler enzim aktivitesi yönünden incelenmiştir. Bu enzimler; lipazlar, amilazlar, proteazlar, ksilanazlar, selülazlar ve pektinazlardır. Toplam 110 adet lipaz (tween 20 substraü), 106 adet amilaz, 55 adet proteaz, 28 adet ksilanaz, 10 adet selülaz ve 3 adet pektinaz aktivitesi saptanmıştır. Ayrıca bu suşlann diğer bazı fenotipik özellikleri de incelenmiştir. Tüm izolatlar, Gram (+), çubuk şeklinde olduklarından ve endospor oluşturduklarından dolayı Bacillus türü olarak tanımlanmışlardır. 16S-ITS r DNA ve plasmid RFLP profilleri, Taq I ve Hae III restriksiyon enzimleri kullanılarak oluşturulmuştur. îzole edilen suşlar, Taq I restriksiyon enzimi profillerine göre 11 farklı gruba ayrılırken, Hae III kesim profillerine göre 9 farklı grup elde edilmiştir. Elde edilen bu gruplar karşılaştırıldığında, 112 adet izolat içinde genotipik olarak 17 farklı susun bulunduğu sonucuna varılmıştır. İzolatlardan 2 tanesi Bacillus stearothermophilus CECT 43 referans susunun RFLP profilleri ile aynı paternleri vermiştir. Ayrıca 'plazmid profillerinin belirlenmesi ' metodu da uygulanmıştır. 23 adet susun plazmid DNA içerdiği belirlenmiştir. Hae III restriksiyon profilleri 3 farklı tip plazmidin varlığım ortaya koymuştur. Termofilik basiller için, Sma I restriksiyon enzimi kullanılarak PFGE optimizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Agaroz kalıpların hazırlanması için yeni bir metot geliştirilmiştir.

ABSTRACT Thermophiles are the organisms which are adapted to live at high temperatures. The enzymes from thermophiles find a number of commercial applications because of their thermöstability and thermoactivity. Therefore, the isolation of thermophilic bacteria from natural sources and their identification are very important in terms of discovering new industrial enzymes. In keeping with this view, Balçova Geothermal Region could serve as a good source for new thermophilic microorganisms with novel industrially important properties. The aim of this research was therefore the isolation of industrially important extracellular enzyme producing thermophilic bacteria from Balçova Geothermal Region and their identification by genetical means. 16S-ITS rDNA RFLP, plasmid profiling and pulsed field gel electrophoresis studies were performed for this purpose. 112 thermophilic strains were isolated from various environmental samples collected within Balçova Geothermal Region. These strains were screened for the existence of 6 extracellular enzyme activities. These were, lipases, amylases, proteases, xylanases, cellulases and pectinases. In total, 110 lipase (tween 20 as substrate), 106 amylase, 55 protease, 28 xylanase, 10 cellulase and 3 pectinase activities were detected. Some other phenotypic tests were also performed for these isolated strains. Since all the isolated strains were Gram (+), endospore forming rods, they were identified as Bacillus sp. 16S-ITS rDNA RFLP and plasmid RFLP profiles were produced by using two restriction endonucleases Taq I and Hae III. The isolated strains were clustered into eleven groups by Taq I restriction profiles of 16S-ITS rDNA while nine groups were obtained by Hae in digestion profiles. When these groups were compared, it was concluded that 17 genotypicalry different strains existed in total 112 isolates. Two of the isolated strains yielded similar RFLP profiles to those of Bacillus stearothermophilus (CECT 43) reference strain. Plasmid profiling was also performed. It was found that 23 of the isolated strains contained plasmid DNA. Hae III restriction profiles indicated the existence of three different types of plasmids. PFGE optimization studies by Sma I restriction endonuclease for thermophilic Bacilli were also performed. A new method for preparation of agarose plugs was developed.