Studies on alkaline protease production from bacillus sp.

Abstract

Bu çalışmada doğal kaynaklarımızdan izole edilip, L18, L21 ve 118 olarak kodlandırılan alkalifilik Bacillus suşlarından alkali proteaz enzimi üretmek için gerekli olan optimum şartların belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmanın bir diğer amacı ise, Bacillus sp. L21'den endüstriyel üretime uygun düşük maliyetli bir besi ortamı geliştirmek suretiyle alkali proteaz üretmek ve geliştirilen bu besi ortamının bileşenlerini deneylerin dizaynı ve yüzey yanıt yöntemi yardımıyla optimize etmektir. Son olarak, L21 susundan elde edilen ham alkali proteazm bazı karakteristik özelliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. L21 ve L18 suşları İYTE Biyoloji Bölümü'nden, 118 susu ise Ege Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden temin edilmiştir. Bacillus olarak tanımlanan ve potansiyel alkali proteaz üreticisi oldukları belirlenen bu suşlardan L18 ve L21 deri fabrikası yan ürünlerinden, 118 ise Ege Üniversitesi kampus toprağından izole edilmiştir. Her üç bakterinin logaritmik büyüme eğrileri oluşturularak spesifik üreme hızları sırasıyla 118 için 0.49, L18 için 0.60 ve L21 için 0.70 saat`1 olarak hesaplanmıştır. Çevresel koşulların alkali proteaz üretimi üzerine etkisini belirlemek için yapılan çalışmalarda L18 ve L21'in 37°C, 118 ise 30°C 'de en iyi ürediği ve bu sıcaklıklarda yüksek aktivitede enzim sentezleyebildikleri saptanmıştır. Aynı şekilde optimum çalkalama hızları L18 ve L21 için 180 rpm, 118 için ise 100 rpm olarak tespit edilmiştir. Her üç bakteri susu için optimum inokulasyon oranı % 5 (v/v) olarak belirlenmiştir. En uygun fermentasyon süresi 118 ve L21 için 96 saat iken L18 için 125 saattir. Ayrıca L18 ve L21 suşları için optimum başlangıç pH değerleri 10.0 olarak belirlenmiştir. L21 susundan alkali proteaz üretmek amacıyla endüstriyel üretime uygun düşük maliyetli bir besi ortamı geliştirme çalışmaları sırasında pepton, KH2PO4, Mg2S04.7H20, ve Na2CÛ3 besiyerinin sabit bileşenlerini oluşturmaktadır. Tarama faaliyetleri sonucunda karbon kaynağı olarak maltoz, azot kaynağı olarak mısır şurubu ve soya küspesi, elementler olarak ise CaCİ2 ve Tween80, incelenmesi gereken faktörler olarak belirlenmişlerdir. Seçilen bu faktörlerin alkali proteaz üretimi üzerine olan bağıl önemleri dört faktörlü (soya küspesi, mısır şurubu, CaCİ2, Tween 80) 2rv 4`1 fraksiyonel faktöriyel tasarım metodu ile incelenmiştir. Bu inceleme sonucunda, soya küspesi, maltoz, Tween 80 konsantrasyonları ve başlangıç pH değerinin alkali proteaz üretimini en çok etkileyen faktörler olduğuna karar verilmiştir.Değişkenler arasındaki karşılıklı etkileşimin saptanabilmesi ve bu değişkenlerin optimize edilmesi amacıyla Box-Behnken dizaynı ve merkezi bileşik dizayn ile yüzey yanıt metodundan faydalanılmıştır. Altı adet etkileşim terimi arasında en önemlileri soya küspesi ile maltoz (Xı*X2) ve Tween 80 ile pH (X3*X4) arasındaki etkileşimlerdir. Ortam pH'ımn nötral değerlerde ve Tween 80'in maksimum seviyelerinde bulunmasını proteolitik aktivite üzerine olumlu bir etki yaratmıştır. Bu modelin doğrulanması amacıyla yapılan ek deneylerde soya küspesi, maltoz, Tween 80 ve pH değişkenleri sırasıyla 2.5 g/L, 15 g/L, 0.35 g/L ve 8.5 değerlerinde tutulduğunda, 294.3 U/mL gibi bir gerçek proteaz aktivitesi elde edilirken, oluşturduğumuz model aynı değeri 338 U/mL olarak tahmin etmiştir. Uygulanan Box-Behnken dizaym ve ek deneyler, seçilen faktörlerin gerçek optimum değerlerinin elde edilmesinde, oluşturulan yüzey yanıt grafiklerinin eyer benzeri bir tabiatta olması nedeniyle yetersiz kalmıştır. Bu nedenle, pH ve Tween 80'in sabit tutulduğu ve soya küspesi ile maltoz konsantrasyonlarının incelendiği, iki faktörlü bir merkezi bileşik dizayn kullanılmıştır. Bu modelin ayarlanmış R2 değeri %93.3 olup, modelin uyumsuz olmadığı saptanmıştır (p- değeri=0.141). Merkezi bileşik dizaynın uygulanmasıyla birlikte soya küspesinin optimum değeri 3.0 g/L olarak belirlenirken, maltoz konsantrasyonu için bu değeri belirlemek amacıyla ek deneylere ihtiyaç duyulmuştur. Sonuç olarak, bu dört değişkenin optimum değerleri pH için 8.0, Tween 80 için 0.35 g/L, soya küspesi için 3.0 g/L ve maltoz konsantrasyonu için 30-40 g/L olarak belirlenmiştir. Bu şartlar altında elde edilen maksimum aktivite değeri 269.2 U/mL'dir. Bu çalışmanın karakterizasyon bölümünde, Bacillus sp. L21'den elde edilen ham alkali proteazm optimum çalışma pH değeri 1 1.0 olup, stabilite çalışmaları sırasında pH 4.0 ve 11.0 aralığında orijinal aktivitesinin yaklaşık %73-78'ini koruduğu gözlenmiştir. Alkali proteazm optimum çalışma sıcaklığı 60°C olarak tespit edilmiş ve 80°C'de bile orijinal aktivitesinin yaklaşık %90'ını koruduğu belirlenmiştir. Termal stabilite analizlerinde alkali proteazm, Ca+2 'nin varlığında ve yokluğunda, 30 dakika ve 1 saatlik inkübasyonlar sonucunda, 30°C ile 50°C sıcaklık aralığında stabilitesini koruduğu, fakat 60°C'de aktivitesinin yaklaşık %40'mı kaybettiği bulunmuştur. L21 susunun ürettiği alkali proteaz bir ağartma ajanı olan I^Ch'e karşı yüksek stabilite göstermiş ve %5 ve %15'lik (v/v) konsantrasyonlarına karşısında aktivitesinin sırasıyla, %82 ve %94'ünü korumuştur. Bu nedenle, ürettiğimiz alkali proteazm ağartmaya dayanıklı bir enzim olarak çeşitli deterjan formülasyonlarında kullanılabileceği düşünülmektedir. EDTA'nın enzimi inhibite etmemiş olması, ürettiğimiz enzimin metalloproteaz olmadığına işaret etmiştir. Bunun yanında PMSF adlı inhibitor proteaz aktivitesini güçlü bir şekilde inhibe etmesi, ürettiğimiz enzimin bir serin proteaz olduğuna işaret etmektedir. Ek olarak, CaCİ2 aktiviteyi %10 kadar düşürdüğünden, inhibitor etki yaratmıştır ve bu da enzimin aktif veya stabil olabilmesi için Ca + iyonların ihtiyaç duymadığını göstermektedir.

The aim of this study was optimization of the conditions for the production of alkaline protease from the Bacillus strains coded as LI 8, L21 and 118, which were isolated from our natural habitats. Additionally, the goal was also to optimize the production of alkaline protease from Bacillus sp. L21 in a new low-cost media formulation by employing design of experiments and response surface methodology. Lastly, the focus was given to the determination of the characteristic properties of the crude alkaline protease of Bacillus sp. L21. The strains L21 and LI 8 were supplied by İYTE Department of Biology, whereas 118 was supplied by Ege University Department of Biology. These potential alkaline protease producer strains identified as Bacillus sp. were isolated from the by products of a leather factory (strains L21 and LI 8) and from the soil of the Ege University Campus (strain 118). Specific growth rates calculated from the slope of the logarithmic phase were as 0.49b`1, 0.60 h`1, 0.70 h`1 for 118, L18 and L21 respectively. When the effects of environmental conditions on alkaline protease production from strains L21, L18 and 118 were studied, the optimum temperatures were determined as 30°C for strain 118 and 37°C for the strains LI 8 and L21. Similarly the optimum agitation speeds were 100 rpm for 118 and 180 rpm for LI 8 and L21. The optimum inoculation ratio was determined as 5% (v/v) for all three strains. The optimum incubation time was determined as 96 hours for the strains 118 and L21 and 125 hours for LI 8. The optimum initial media pH was estimated as pH 10 for strain LI 8 and L21. The constant medium constituents in the development of a low-cost medium study were peptone, KH2PO4, Mg2S04.7H20, and Na2C03. At the end of screening experiments, the factors considered include, soybean meal and corn steep liquor as nitrogen source, maltose as carbon source, CaCİ2 and Tween 80 as elements. The relative importance of these factors on alkaline protease production was investigated by using a resolution IV fractional factorial design with single replicate of treatment combinations of four factors (soybean meal, corn steep liquor, CaCİ2, Tween80). Soybean meal, maltose, Tween80 concentrations and initial pH were found to significantly influence the alkaline protease production.For obtaining the mutual interaction between the variables and optimizing these variables, Box-Behnken design and central composite design (CCD) using response surface methodology was employed. Among six interaction terms only those of soybean meal and maltose (Xı*Xı) and Tween80 and pH (X3*X4) were found to be significant. The neutral pH values of the medium and Tween 80 around its maximum level has a positive effect on proteolytic activity. Additionally, 4 sets of validation experiments were employed. The validation experiment, which state soybean meal, maltose, Tween 80 and pH as 2.5 g/L, 15 g/L, 0.35 g/L and 8.5, respectively, yielded an actual protease activity of 294.3 U/mL, where the model estimated a value of 338 U/mL. The Box- Behnken design and validation experiments were not sufficient to determine the true optimum values for the significant factors because of the saddle nature of the response surfaces. Therefore pH and Tween 80 were kept constant and a central composite design with two factors (soybean meal and maltose concentrations) was conducted. The adjusted R of the model was 93.3% with an insignificant lack of fit (p value=0.141). The CCD was able to determine the optimum value of soybean meal as 3.0 g/L, however it could be determined for maltose concentration after a set of additional experiments. Consequently, the optimum values of the four factors were determined as 8.0 for pH, 0.35 g/L for Tween 80, 3.0 g/L for soybean meal and 30-40 g/L for maltose concentration. The maximum activity under these conditions was 269.2 U/mL. In the characterization part of this study, the crude alkaline protease of Bacillus sp. L21 displayed a pH optimum of 11.0 and retained about 73-78% of its original activity between pH 4.0 and 1 1.0 in the stability studies. The optimum temperature for protease activity was found to be 60°C and retained about 90% of the original activity even at 80°C. By analyzing the thermal stability, the alkaline protease was found to be stable in a temperature range of 30°C to 50°C but lost about 30% of its activity at 60°C, after 30 min and 1 hour incubations both in the presence and absence of Ca2+. The protease from strain L21 showed high stability against both 5% and 15% (v/v) concentrations of H2O2, which is a bleaching agent, and retained approximately 82% and 94% of its activity, respectively, therefore, the present alkaline protease is thought to be a bleach-stable enzyme, so that it can be used in detergent formulations. There was no inhibitory effect observed from EDTA that further show that the enzyme is not a metalloprotease. However, PMSF (phenylmethyl sulphonyl fluoride) strongly inhibited the protease activity, suggesting that the enzyme is a serine protease. In addition, CaCİ2 showed inhibitory effect on the enzyme, decreasing the activity to 90% of the control and this can be explained that the enzyme do not require the presence of Ca ions to be active and stable.