Isolation and characterization of Bacillus thuringiensis from olive tree-related habitats

Abstract

ÖZET Bacillus thuringiensis (Bt) Gram-pozitif, sporlu bir toprak bakterisi olup, sporlarıma döneminde insektisidal özellik gösteren kristal protein üretir. Bu kristal proteinlere 2#-toksin veya 8-endotoksin adı verilir. Toksinlerin en önemliği özelliği birçok böcek türüne karşı insektisidal etki göstermesidir. İnsektisidal potansiyeli keşfedildiğinden beri, dünyanın pekçok yerinde Bt ticari olarak üretilmekte ve mikrobiyal pestisit olarak kullamlmaktadır. Bu çalışmanın amacı, zeytinle ilgili alanlardan Bt izole etmek, bu izolatlarm fenotipik ve genotipik özelliklerini belirlemektir. Bu amaçla, Ege Bölgesinden 240 adet örnek toplanmıştır. Faz-kontrast mikroskobu ile 54 örnekten izole edilen 100 adet Bt izolatının kristal protein ürettiği belirlenmiştir. Kristal proteinlerin morfolojisi, küresel, bipiramidal, kübik, düzensiz noktasal, ve düzensiz şekilli olarak farklılık göstermektedir. En fazla izolat, toprak örneklerinden elde edilmiştir. Diğer izolatlar, yaprak kalıntısı, taze zeytin yaprağı, fekal örnekler, toz, ve zeytin pirinasından izole edilmiştir. İzolatlar, biyokimyasal özelliklerine, cry ve cyt gen içeriğine, plazmid ve 16S-ITS rDNA RFLP profillerine göre karakterize edilmiştir. Biyokimyasal testler ile proteaz (kazeinaz ve jelatinaz), lesitinaz, amilaz, nükleaz, üreaz, eskülinaz, arginin hidrolizi aktivitelerine, sukroz, şalisin, mannoz, sellobioz ve maltozu fermente etme yeteneklerine ayrıca asetil-metil-karbinol üretme yeteneğine bakılmış ve metil kırmızısı testi uygulanmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) cryl, cry 2, cry 4, cry 9, cryll, cry 13 cytl, ve cyt2 genlerini belirlemek için uygulanmıştır. İzolatlarm %68'i cryl; %57'si cry4; 20%'si cryll; 26%'sı cry9; 20%'si cry2 genlerini amplifiye etmiştir; izolatlar cryl3 genini içermemektedir. Cytl geni izolatlarm %40'ında; cyt2 geni izolatlarm 80%'inde bulunmaktadır. İzolatlarda en fazla cryl ve cry 4 genotipine rastlanmıştır, izolatlarm büyük bir çoğunluğu (58%) birden fazla cry geni içermektedir. Plazmid profilleri izolatlarm tamamının plazmid içerdiğini, çoğu izolatm ise birden fazla plazmid taşıdığım göstermiştir. Benzer biyokimyasal özellik gösteren bazı izolat ve referansları smıflandranak için 16S-ITS RFLP yönteminin ayran gücü test edilmiştir.

ABSTRACT Bacillus thuringiensis (commonly referred to as Bt) is a Gram-positive, spore- forming soil bacterium that produces insecticidal crystal proteins during sporulation. These crystals are referred as Bt toxins or 8-endotoxins. The most important characteristics of the toxins are their insecticidal activity against many insects. Since their insecticidal potential has been discovered, it has been produced commercially and used as microbial pesticides all over the world. Therefore, the aim of this study was to isolate Bt from olive tree-related habitats, and to determine the phenotypic and genotypic characteristics of the isolates. To accomplish this purpose, 240 samples were collected in the Aegean Region. The phase-contrast microscopy results showed the presence of crystals in 54 environmental samples, corresponding to 100 Bt isolates. The crystal morphologies were spherical, bipyramidal, cuboidal, irregular pointed, and irregular shaped. The greatest proportion of samples yielding this organism was from the soil. The remaining were from olive leaf residue, green olive leaves, animal faeces, dust samples, and olive pomace. The isolates were characterized on the basis of biochemical characters, cry and cyt gene content, plasmid profiling, 16S-ITS rDNA RFLP. Biochemical tests included protease (caseinase and gelatinase), lecithinase, amylase, nuclease, urease, esculinase, arginine dihydrolyse activity; fermentation of sucrose, salicin, mannose, cellobiose, and maltose, production of acetyl-methyl- carbinol, methyl red reaction. Polymerase chain reaction (PCR) has been applied for the identification of cryl, cry2, cry4, cry9, cryll, cryl3, cytl, and cyt2 genes. 68% of the isolates amplified cryl gene; 57% amplified cry4/ 20% amplified cryll; 26% amplified cry9; 20% amplified cry2 genes, and none of the isolates harbored cryl 3 gene. Cytl gene was found in 40% of the isolates while cyt2 gene was present in 80% of the isolates. The most abundant genotype of cry genes was cryl and cry4. Most of the isolates (58%) possessed more than one cry gene. In addition, different combinations of cry and cyt genes were obtained. Plasmid profiling showed the presence of plasmids in all isolates and the number of plasmids was usually more than one. Also, the discrimation effect of 16S-ITS rDNA RFLP was tested to differentiate certain isolates and reference strains, which showed similar biochemical characteristics. IV