Partial Purification and Characterization of Lipase Enzyme from a Pseudomonas Strain

Abstract

Lipazlar enzimi, triaçilgliserol hidrolaz bir enzim olup suda çözünmeyen serbest yağ asitlerin ve gliserollerin hidrolizini ve birçok kimyasal reaksiyonu katalizlerler. Dahası mikrobial olarak üretilen bir lipase enzimi organik sentezlerde enantiomerik seçiciliği ve özel bölge bağlanmaları ya da kırılmaları seçiciliği gösterir. Bu yüzden mikrobial olarak üretilen lipaz enzimi endüstriyel uygulamalarda ve organik sentez tasarımlarında önem kazanmıştır. Bu çalışmada Pseudonomas suşundan elde edilen lipaz farklı analitik yöntemler kullanılarak varlığı kanıtlamış, kısmen saflaştırılmış ve karakterizasyonu yapılmıştır.Saflaştırma işlemi boyut dışlamalı kromatografi kullanılarak yapılmıştır. Kısmı olarak saflaştırılan enzimin moleküler ağırlığı poli akrilamit jel elektroforezi kullanılarak tespit edilmiştir. Spektrofotometrik çalışma ile enzim karakterizasyonu yapılmıştır. Ayrıca bunun yanında enzimin kinetik çalışması da yapılmıştır. Elektroforez işleminden sonra, potansiyel lipase activitesi gösteren protein bantları gel üzerinde görüntülenmiştir.Topraktan izole edilmiş Pseudonomas suşunun farklı denemelerde ortaya çıkan lipaz aktivite sonuçları gözlendikten sonra, enzimin hücre içinde çalışan bir enzim olduğuna ve yapılacak saflaştırma ve karakterizasyon çalışmalarının bu bilgi göz önüne alınarak yapılmasına karar verilmiştir. Enzim, p-nitrofenil laurate'in substrat olarak kullanıldığı çalışmalarda en yüksek enzim aktivitesini göstermiştir. Lipaz enziminin çalışması için en uygun pH aralığının pH 8.0-9.0 civarında, alkali pH aralığında olduğu tespit edilmiştir. Uygun sıcaklık değeri ise 25oC olarak belirlenmiştir. Metal tuzları ve organik çözücüler varlığında, enzim aktivitesi kimi katkı bileşikleri varlığında hızlı bir şekilde düşerken, kimi katkı bileşikleri varlığında etkilenmeden sabit kalmıştır. Kısmı olarak saflaştırılmış lipaz enziminin yaklaşık molekül ağırlığı 23 kDa ve 49 kDa aralığında bulunmuştur.

Lipase is a triacylglycerol-hydrolyzing enzyme which is catalyzed the hydrolysis of water insoluble free fatty acid and glycerols and also a wide range of chemical reactions. Beside, microbial lipases show regiospecificity and enantioselectivity properties. Therefore, microbial lipases gain the great importance for industrial applications and organic synthesis. In this study, investigation, partial purification and characterization of lipase enzyme from a Pseudomonas strain was studied by using different analytical approach.Purification step was done by size-exclusion chromatography. The molecular weight of partial purified lipase was determined by SDS-PAGE. Spectrophotometric lipase assay applied to find out the enzyme characterization. Kinetic study of enzyme was also investigated varying the substrates concentrations. Specific activity staining on gel procedures applied after native gel process. After electrophoresis, lipase activity responsive protein bands were appeared on gel.After screening for the presence of lipase activity in Pseudonomas strain which was isolated from soil, it was decided to choose intracellular enzyme sample for characterization and purification studies. The enzyme gave the highest lipase activity when p-nitrophenyl laurate used as a substrate. The optimum pH range for activity of lipase was alkaline pH ranges, about pH 8.0 and 9.0. The optimum temperature was dedicated as 25oC. In the presence of metal salts and organic solvents; while some additives sharply decreased enzyme activity, some additives were not effect the enzyme activity. Approximate molecular mass of partially purified enzyme was between 29 kDa and 43 kDa.