Effects of liposome encapsulation, spray drying, and ascorbic acid presence on color stability of black carrot anthocyanins

Abstract

Gıda renklendiricileri, tüketici algısını etkilediği için gıda endüstrisinde önemli bir yere sahiptir. Gıdanın tazeliği, çeşidi, içeriği ve üretim metodu gıdanın rengini belirleyen önemli etmenlerdendir. Çekici bir renk tüketiciler tarafından tercih edilmekte ve tüketicilerin satın alma alışkanlıklarına etki etmektedir. Sentetik renklendiriciler, proses koşullarına dayanıklılıklarının yüksek olmasından ve düşük miktarlarda kullanımlarının iyi sonuç vermesinden dolayı yıllarca tercih edilmişlerdir. Fakat, son yıllarda sentetik renklendiricilerin sağlık üzerindeki olumsuz etkilerinin vurgulandığı çalışmaların çoğalması ve dünyada sağlıklı beslenme eğiliminin artması sonucu üreticiler doğal renklendiricilerin kullanımına yönelmişlerdir. Doğal renklendiricilerin kullanılmasında, üretim ve çevre koşullarına dayanıklılığın düşük olması problem oluşturmaktadır. Sentetik renklendiricilere getirilen yasal sınırlamalar ve kamuoyu etkisi doğal renklendiriciler ile ilgili çalışmaları arttırmıştır. Doğal renklendiriciler arasında kara havuç, antioksidan niteliği yüksek bir tarımsal ürün olarak sağlık açısından her geçen gün önem kazanmaktadır. Ana vatanı Türkiye ve Orta-Uzak Doğu bölgeleri olarak bilinen kara havucun Dünyada en az 3000 yıldan bu yana kültürü yapılmaktadır. Kara havuç (Daucus carota var L.) açillenmiş antosiyanin bakımından zengin bir tür olmasına rağmen halen özellikle reaktif bileşenlerin (örneğin, C vitamini) bulunduğu ortamlarda bozunmaktadır. Enkapsülasyon, gıda matrisi içerisinde korunmak istenen öz madde ve çevre koşulları arasında bariyer oluşturulması işlemidir. Bu nedenle, doğal renklendiricilerin dayanıklılığı enkapsülasyon ile arttırılarak sentetik renklendiricilerin kullanım ihtiyacının ortadan kaldırılması sağlanabilinmektedir.Bu tez çalışması, yukarıda belirtilen bilgiler doğrultusunda kara havuç antosiyaninlerinin karakterizasyonunun gerçekleştirilmesi ve kara havuç antosiyaninlerinin lipozom ile enkapsülasyonunun bu bileşenlerin dayanıklılığına etkisinin araştırılması üzerine kurgulanmıştır. Bu doktora tezinin amaçları sırasıyla; (i) Kara havuç ekstraktının antosiyanin konsantrasyonu, fenolik içeriği, antioksidan aktivitesi ve renk özellikleri dikkate alınarak kara havuç ekstraksiyonu koşullarının Yanıt Yüzey Metodolojisi kullanılarak belirlenmesi, (ii) açillenmiş antosiyanin oranı fazla, dayanıklılığı yüksek kara havuç antosiyaninlerinin askorbik asit varlığında dayanıklılığının incelenmesi ve lipozom ile enkapsülasyonun aynı koşullarda kara havuç antosiyaninlerin dayanıklılığına etkisinin araştırılması, (iii) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi analizi ile lipozom enkapsülasyonu ve kara havuç antosiyaninlerinin molekül içi kopigmentasyonunun askorbik asit varlığında kara havuç antosiyaninlerinin dayanıklılığına etkisinin belirlenmesi, (iv) lipozomların kara havuç antosiyaninlerinin varlığında ve yokluğundaki fiziksel ve kimyasal dayanıklılığının depolama süresince belirlenmesi, (v) kara havuç ekstraktı içeren lipozomların püskürtmeli kurutma işlemi sırasındaki dayanıklılığının tespit edilmesidir.Tezin ilk bölümünde kara havuç ekstraksiyonu için en uygun koşulların belirlenmesi yanıt yüzey yöntemi kullanılarak belirlenmeye çalışılmıştır. Antosiyaninlerin ekstraksiyonuna etki eden faktörlerden pH, sıcaklık, çözgen/katı madde oranı ve etanol/su oranı ekstraksiyon parametreleri olarak seçilmiştir. İki tekrarlı merkezi kompozit tasarım kullanılarak bu faktörlerden deneme deseni çıkarılmıştır. Faktörlerin minimum ve maksimum değerleri ön çalışmalar ile belirlenmiş olup pH, sıcaklık, çözgen/katı madde oranı ve etanol/su oranı için sırasıyla 2,5-6,5, 4-72°C, 5:1-25:1, ve 0:100-100:0 değerleri belirlenmiştir. Elde edilen ekstraktlara toplam fenolik madde miktarı, toplam monomerik antosiyanin miktarı, polimerik renk, toplam antioksidan aktivitesi ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi kullanılarak antosiyanin kompozisyon analizleri yapılmıştır. Renk analizleri haricinde, yüksek sıcaklık, çözgen/katı madde oranı ve etanol/ su oranının ekstraksiyon verimini arttırdığı tespit edilmiştir. Ancak, polimerik renk analizlerinin en düşük olduğu noktalar; düşük pH değerleri ve çözgen/katı madde oranı, düşük veya orta dereceli sıcaklıklar ve yüksek etanol oranı olarak belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre en uygun ekstraksiyon değerleri; pH 3,5, sıcaklık 50°C, çözgen/katı madde oranı 10:1 (v/w) ve etanol/su oranı 75:25 (v/v) olarak bulunmuştur. Yanıt yüzey yöntemiyle teorik olarak bulunan en uygun koşullar ile ekstraksiyon işlemi tekrarlanmış ve teorik model deneysel sonuçlarla desteklenmiştir. Böylece elde edilen modelin uygulanabilir olduğu belirtilmiştir.Tezin ikinci bölümünde ise kara havuç antosiyaninlerinin farklı koşullarda dayanıklılığı incelenmiştir. Açillenmiş antosiyanin oranı yüksek kara havuç antosiyaninleri diğer antosiyanin kaynaklarına göre göreceli olarak farklı koşullarda daha dayanıklı olabilmektedir. Fakat C vitamini (L-askorbik asit) varlığında antosiyaninlerde zamanla bozunma gözlemlenebilmektedir. Bu nedenle, kara havuç ekstraktının farklı oranlarda askorbik asit varlığında dayanıklılığı UV/VIS spektroskopisiyle farklı zamanlarda alınan örneklerle incelenmiştir. Artan askorbik asit miktarının ekstraktın bozunmasını arttırdığı gözlenmiştir. Bu nedenle, lipozom ile enkapsülasyonun antosiyanin dayanıklılığına etkisi incelenmiştir. Farklı lesitin konsantrasyonları (%1, %2 ve %4) ve farklı antosiyanin miktarları (%0,1, %0,2 ve %0,4) kullanılarak yüksek basınçlı homojenizasyon yöntemi ile kara havuç ekstraktı içeren lipozom üretimi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen lipozomların fiziksel karakterizasyonu için partikül boyutu (41-46 nm) ve zeta potansiyel analizleri [(-23)-(-20) mV] gerçekleştirilmiştir. Lipozomların enkapsülasyon etkinliği UV/VIS spektroskopisiyle belirlenmiş olup artan lesitin konsantrasyonlarının enkapsülasyon etkinliğini %50'ye kadar arttırdığı belirlenmiştir. Kara havuç ekstraktının lipozom ile enkapsülasyonu sonucunda, kara havuç ektraktlarının renk özelliklerinin askorbik asit varlığında iyileştiği gözlenmiştir. Bu çalışma ile askorbik asit varlığında antosiyaninlerin bozunmasının lipozom enkapsülasyonu ile azaltılabileceği gösterilmiştir.Tezin üçüncü kısmında ise, çalışmanın daha önceki bölümlerinde lipozom ile enkapsülasyonun antosiyaninleri koruma etkisi gözlendiği için bu bilgiden yola çıkılarak açillenmiş antosiyaninlerin ve açillenmemiş antosiyaninlerin lipozom ile enkapsülasyonundan önce ve sonra askorbik asit varlığında antosiyanin miktarındaki değişim araştırılmıştır. Bu nedenle kara havuç ekstrasktlarının lipozom ile enkapsülasyonu gerçekleştirilmiş ve fiziksel karakterizasyonları yapılmıştır. Elde edilen lipozomların boyutu 50 nm'den az olarak ölçülmüştür. Zeta potansiyeli ise (-23)-(-20) mV olarak bulunmuştur. Enkapsülasyon etkinlikleri yüksek basınçlı sıvı kromatografisi kullanılarak antosiyanin miktarı üzerinden hesaplanmıştır. En yüksek enkapsülasyon etkinliği %60 olarak belirlenmiştir. Farklı miktarlardaki askorbik asit (%0,01, %0,025, %0,05 ve %0,1 w/w), kara havuç ekstraktı (%0,2) içeren lipozom (%1, %2 ve %4 lesitin içeren) örneklerine ve sadece %0,2 ekstrakt çözeltisine uygulanmıştır. Depolama süresince alınan örneklerde yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile her bir antosiyaninin miktarındaki değişim gözlenmiş olup lipozom ile enkapsülasyonun sinapik, ferülik ve kumarik asit ile açillenmiş siyanidin türevlerine pozitif bir etkisi olduğu belirlenmiştir.Tezin dördüncü aşamasında ise, kara havuç ekstraktı içeren ve içermeyen lipozomların fiziksel ve kimyasal dayanıklılığı depolama süresince ölçülmüştür. Bu çalışmada %0,1, %0,2 ve %0,4 w/w kara havuç ektraktı içeren farklı lesitin konsantrasyonlarında (%1, %2 ve %4) lipozomlar üretilmiştir. Ayrıca, hiç ekstrakt içermeyen %1, %2 ve %4 konsantrasyonlarında lesitin içeren lipozomlar üretilmiştir. Üretilen lipozomların fiziksel karakterizasyon analizleri yapılmıştır. Başlangıç örnekleri ve 21. güne ait örneklerde partikül boyutu ve zeta potansiyeli özellikleri karşılaştırılmıştır. Partikül boyutları 50 nm'nin altında bulunmuş olup depolama süresince istatistiksel olarak bir değişim gözlenmemiştir (p<0,05). Lipozomlara antosiyanin miktarı, fenolik madde miktarı ve antioksidan aktivitesi analizleri uygulanarak lipozomların biyokimyasal dayanıklılığı tespit edilmiştir. Lipozom üretiminde fosfolipidler kullanılmaktadır. Lipozomların kimyasal stabilitesi oksidasyon analizleri ile belirlenmiştir. Bu doğrultuda gaz kromatografisi kullanılarak ekstrakt içeren ve içermeyen lipozomlara hekzanal analizleri uygulanmıştır. Sonuçlar incelendiğinde, çoklu doymamış yağ asiti içeren lesitinlerin oksidasyonunun kara havuç antosiyaninleri ile önlenebileceği görülmüştür. Ayrıca, lipid konsantrasyonunun kara havuç antosiyaninleri ile oksidasyonun önlenmesine etkisi belirlenmiştir. Bu çalışma ile lipozomlara antosiyanin eklenmesinin doymamış yağ asitlerin oksidasyonunun önlenmesi üzerinde etkili olduğu belirlenmiş ve önemli veriler elde edilmiştir.Tezin son kısmında ise kara havuç antosiyaninlerinin farklı sistemler (sadece ekstrakt, ekstrakt içeren lipozom, kitosan ile kaplanmış lipozom içerisinde ekstrakt ve kitosan ile ekstrakt karışımı) içerisinde püskürtmeli kurutucu ile enkapsülasyonu çalışılmıştır. Kara havuç antosiyaninlerini içeren birincil ve ikincil lipozom örnekleri fiziksel olarak başarılı bir şekilde püskürtmeli kurutma işlemi sonrasında elde edilmiştir. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizleri sonucunda tozların morfolojik özellikleri belirlenmiştir. Lipozom içeren ürünlerde herhangi bir çatlak gözlenmemiştir. Fakat biyokimyasal analizlerde lipozom içeren örnekler, sadece kara havuç ekstraktı ve kara havuç-kitosan karışımı örneklerinden daha düşük dayanıklılık göstermiştir. Bu tez çalışmasında kara havuç antosiyaninlerinin gıda renklendiricisi olma potansiyeli hem enkapsülasyon aşamasından sonra hem de askorbik asit varlığında değerlendirilmiştir. Kısa dönem depolama sonuçlarına göre, askorbik asitin kara havuç antosiyaninleri üzerindeki olumsuz etkisi lipozom enkapsülasyon metodu ile azaltılmıştır. Ayrıca, uygulanan lipozom sisteminin şeffaf ve berrak olmasından dolayı içecek sektörü için uygun olduğu görülmüştür. Fakat uzun dönem depolama sırasında lipozom ile enkapsülasyonu sağlanan antosiyaninlerde renk kaybı olduğu tespit edilmiştir. Tezin içinde de belirtildiği gibi kopigmentasyonun enkapsülasyona etkisi farklı fenolik bileşikler kullanılarak, lipozomlara ikincil bir kaplama yapılarak veya doymuş yağ asitleri içeren lesitin kaynağı kullanılarak ileriki çalışmalarda engellenebilir. Diğer yandan, uzun dönem depolama sonuçlarında öne çıkan bir başka sonuç ise antosiyaninlerin lipozomların oksidasyonunu engellediği veya ertelediğidir. Bu şekilde lipozomal sistemlerde kopigmentasyon arttırılarak iki yönlü koruma sağlanabilir. Böylece, enkapsüle edilmiş kara havuç antosiyaninleri zorlu proses koşullarında bile dayanıklılığını koruyabilir

In the food industry, food colorants determine the food preferences of customers as color of a food is a function of freshness, type, ingredients and production method. In addition, it also affects customers' purchase behavior since an appealing color is highly desired by consumers. In today's world, food products are transported to far away places where they will be consumed. This may result in degradation and appearance loss. In addition, food producers desire to sell their products with an optimum color, and, therefore, food colorants are used extensively. In recent years, the increasing tendency of customers to consume healthy foods has led the food industry to seek natural colorants instead of stable synthetic colorants due to possible harmful effects of synthetic colorants. Black carrot anthocyanins are water soluble and pH sensitive natural pigments. Black carrots are currently grown in the center part of Turkey as a highly nutritive crop. In addition, it is currently used in shalgam production and the canned food industry due to its high anthocyanin content. Furthermore, black carrot (Daucus carota var L.) is a potential source of acylated anthocyanins. Thus, black carrot anthocyanins are relatively stable. Nevertheless, they still suffer from degradation, that is they loose their color over time, especially in systems containing other reacting compounds such as vitamin C. In a food system, encapsulation is generally used to create a barrier between the component and environment. Encapsulation may be a suitable method to enhance their stability to the point where they may be used to replace synthetic colorants. In this research a framework on characterization of black carrot anthocyanins and liposome encapsulation effect on stability of black carrot anthocyanins has been developed. The objectives of this Ph.D. thesis were (i) to optimize black carrot extraction using Response Surface Methodology (RSM) by evaluating anthocyanin concentration, phenolic content, antioxidant activity, and color attributes of black carrot; (ii) to compare the stability of black carrot anthocyanins, which are highly stable due to their large amount of acylated anthocyanins, with and without a liposome system in the presence of ascorbic acid; (iii) to understand the effects of both intramolecular copigmentation and liposome encapsulation on ascorbic acid related anthocyanin degradation; (iv) to investigate physical and chemical stability of liposomes with and without black carrot during storage; (v) to evaluate the stability of liposomes with black carrot extract during the spray drying process. In first part of the thesis, optimum conditions for the extraction of black carrot anthocyanins were determined by response surface methodology. Central composite design of extraction factors (pH 2.5–6.5, temperature 4–72 °C, solvent/solid ratio 5:1–25:1 v/w, ethanol/water ratio 0:100–100:0 v/v) was generated as two replicates. Total phenolic content, total monomeric anthocyanin content, polymeric color, total antioxidant activity, and anthocyanin composition determined by high performance liquid chromatography (HPLC) were used as responses. Except for color values, higher temperature, solvent/solid ratio, and ethanol concentration were observed to increase the extraction yield. However, polymeric color results were found to have minimum values at lower pH and solid/ solvent ratio, lower or moderate temperature, and higher ethanol concentration. Optimum extraction conditions were found as follows: 50 °C, pH 3.5, solvent solid ratio 10:1 (v/w), and ethanol/water ratio 75:25 (v/v) when all responses were considered. The validation of the optimum conditions for black carrot extraction was performed at specified values. Optimum extraction conditions were valuable to protect anthocyanins at the first step for further processes. In the second part, stability of black carrot anthocyanins is evaluated in the presence of L-ascorbic acid. The degradation of vitamin C (L-ascorbic acid) on anthocyanins is a known fact in beverage systems. In this part, the effects of various liposomal systems, including black carrot extract (0.1%, 0.2%, 0.4% w/w) and lecithin (1%, 2%, 4% w/w), on the color and degradation of anthocyanin in different ascorbic acid (0.01%, 0.025%, 0.05%, 0.1% w/w) concentrations were examined via UV/VIS spectroscopy and visual control of the color. The physical characteristics of the liposomal systems resulted in particle diameters of 41–46 nm and zeta-potentials of (−23)–(−20) mV. The encapsulation efficiencies of the liposomal systems increased up to 50% with increasing lecithin concentrations. The encapsulation of black carrot extract in liposomes enhanced the color and stability of the anthocyanins during storage. This study showed that the degradation of anthocyanins due to ascorbic acid can be reduced by liposomes in aqueous solutions. In the third part, the protective effect of the anthocyanin acylation and liposomal encapsulation of black carrot extract (BCE) on anthocyanin degradation was investigated in the presence of ascorbic acid. BCE (0.1%, 0.2%, 0.4% w/w) were encapsulated in liposomes using different lecithin concentrations (1%, 2%, 4% w/w). Physical characterization of liposomes was performed. Particle diameters were found to be less than 50 nm and ζ-potentials of (-23)-(-20) mV. Encapsulation efficiency determined by HPLC indicated that increasing lecithin concentrations raised the efficiency at the same BCE concentration up to 60%. Different concentrations of AA (0.01%, 0.025%, 0.05%, 0.1% w/w) were added to the BCE solutions and liposomes (1%, 2%, 4% lecithin) containing BCE (0.2% w/w). AA related color loss and individual anthocyanin degradation were examined by UV/VIS spectroscopy and HPLC, respectively. This study presented the potential positive effect of liposomal encapsulation on individual particularly acylated anthocyanins (sinapic, ferulic and p-coumaric acid derivates of cyanidin-3-xylosylglucosylgalactoside).In the fourth part, the protection effect of black carrot anthocyanins on the stability of liposome was evaluated during storage. Physical and chemical stability of extracts (0.1%, 0.2%, and 0.4% w/w) including liposomes with various lecithin content (1%, 2%, and 4% w/w) were demonstrated. Z-average particle diameter and zeta potentials of liposomes were evaluated before and after 21 days of storage. Particle diameter of samples were found to be lower than 50 nm after storage and no statistical change was determined (p<0.05). Extract degradation, phenolic content, and antioxidant capacity of liposomes were also evaluated during storage to evaluate the biochemical stability. Hexanal analysis was performed to investigate the lipid oxidation in liposomes within 60 days. According to the results, oxidation of polyunsaturated fatty acids may be inhibited with the addition of extract to liposomes, however, lipid content should be limited according to the extract concentration. The study provided valuable data on the contribution of anthocyanin addition to liposomes to overcome oxidation of unsaturated phospholipids.In the final part, spray drying of black carrot anthocyanin were evaluated in different encapsulation systems (extract only, primary and secondary liposome systems and chitosan extract mixture). BCE included primary and secondary liposomes were successfully spray dried. All samples were found physically stable after spray drying processing. In addition, SEM images of liposomal systems showed powder without any crack that indicates stability of liposome systems to spray drying. However, liposome samples showed lower stability compared to BCE and BCE and chitosan mixtures according to the biochemical analysis of reconstituted powders. To sum up, detailed analyses of colorant potential of black carrot anthocyanins in encapsulation and ascorbic acid conditions were evaluated. Short term storage results showed liposome encapsulation may provide enhancement of color attributes of black carrot in the presence of ascorbic acid. In addition, our liposomal system are clear and transparent and suitable for beverage industry. However, color loss in liposomal system was observed in long term storage. This may be prevented with copigmentation with other phenolics, second layer on liposomes, or using saturated lecithin source. On the other hand, results showed us anthocyanins can be used to reduce the oxidation rate of liposomes. Those studies lead us increase of copigmentation in liposomal system may result in mutual protection. Therefore, encapsulated black carrot anthocyanins can be used as natural colorants stable in process conditions.