Identification of the interaction partners of anti-apoptotic BAG-1M isoform in breast cancer and breast epithelial cells

Abstract

BAG-1 (Bcl-2 ilişkili athanogen-1) bir çok organizmada evrimsel süreçte korunmuş olan BAG ailesine ait anti-apoptotik bir proteindir. Hücre içerisinde önemli mekanizmada görev alan BAG-1, çok fonksiyonlu adaptör protein olarak bilinir. HSP70/HSC70 ısı şoku proteinleri, E3 ubikuitin protein ligazlar, nükleer hormon reseptörleri, Raf-1 serin/treonin kinaz ailesi ve Bcl-2 proteini gibi çeşitli moleküllerle olan etkileşimler ile BAG-1 transkripsiyon, hormon aktivitesi, hücre büyümesi, hücre hareketliliği ve proliferasyonu, tümörigenez, apoptoz mekanizması ve hücre içindeki önemli sinyal yolaklarını düzenlemektedir. BAG-1'in hücrenin yaşamını sürdürmesini sağlamakta olduğu düşünülmektedir. Yapılan çalışmalar meme kanseri, kolon kanseri ve prostat kanseri başta olmak üzere çeşitli kanser türlerinde BAG-1'in yüksek oranda ifade edildiğini göstermektedir. Hücre içerisindeki fonksiyonları göz önünde bulundurulduğu zaman BAG-1'in özellikle meme kanserinin oluşum ve gelişim sürecinde BAG-1'in önemli rolü olduğu düşünülmektedir.BAG-1 proteini aynı mRNA üzerindeki farklı başlangıç bölgelerinden translasyon sonucu oluşan üç ana izoformdan oluşmaktadır. BAG-1'ın üç izoformu da C-ucunda BAG domaini ve ubikuitin benzer domaini bulundurmaktadır. İzoformlar arasındaki fark N-ucu bölgesinden kaynaklanmaktadır. En büyük izoform olan BAG-1L, N-ucunda nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir ve nükleusta bulunur. BAG-1S hücre içerisinde en baskın olarak bulunan ve sitoplazmada lokalize olmuş en küçük BAG-1 izoformudur. BAG-1M ise ekspresyon seviyesi BAG-1L ve BAG-1S'ye kıyasla daha az olan ve nükleer lokalizasyon sinyali bulunmamasına karşın çeşitli aracı proteinler ile hem sitoplazma hem de nükleusta lokalize olabilen BAG-1 izoformudur. İzoformların bulundukları doku ve hücreye göre özelleşebildiği bilinmekte ancak izoform spesifik çalışmalar ile her bir BAG-1 izoformun etkileştiği proteinler ve görev aldığı mekanizmalar ile ilgili detaylı bilgi bulunmamaktadır.BAG-1M'nin hem sitoplazma hem de çekirdekte bulunabilmesi, bu izoformun hem DNA hem de sitoplazmik proteinler ile etkileşerek kanser sürecinde görev alabileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmada BAG-1M izoformunun öncelikle BAG-1'in bilinen etkileşim partnerleri ile olan etkileşiminin incelenmesi ve hücre sağkalımı üzerindeki etkisinin gösterilmesi, sonrasında ise etkileşim partnerlerinin meme kanseri ve meme epitel hücrelerinde tespit edilmesi amaçlanmıştır. Yapılan bu çalışmanın BAG-1M'nin kanserli ve meme epitel hücrelerindeki farklı etkileşimleri göstererek bu izoformun meme kanseri oluşum ve gelişim sürecindeki rolünün aydınlatılmasına katkıda bulunması hedeflenmiştir.BAG-1M'nin etkileşim partnerlerinin tespit edilebilmesi için öncelikle N-ucu TAP etiketi içeren BAG-1M dizisini içeren vektör plazmid hücrelere transfekte edilmiş, ardından TAP etiketi pürifikasyonu ile transfekte edilen hücrelerden elde edilen total protein içerisinden BAG-1M saflaştırılmıştır.xxivBAG-1M'nin hücre sağkalımındaki etkisi transfekte edilmemiş hücrelerle karşılaştırmalı olarak gösterilmiş, BAG-1M izoformunun yüksek ifadesinin hücre proliferasyonunu ve hücrelerin koloni oluşturma yatkınlığını arttırdığı hücre canlılığı testleri ile gösterilmiştir.BAG-1'in bilinen etkileşim partnerleri olan HSP-70, Bcl-2, Raf-1, Akt, Raf-1 ve Akt'ın sırasi ile 338. ve 473'üncü serinlerinden fosforillenmiş formları ile BAG-1M etkileşiminin olduğu saflaştırılan BAG-1M örneklerinde immün blotlama ile gösterilmiştir.Bilinen etkileşim partnerleri dışındaki etkileşen proteinlerin tespit edilmesi amacıyla saflaştırılan BAG-1M proteini tripsin ile peptitlerine parçalanmış ve peptit haritalama yöntemi için sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile analiz edilmiştir. Tespit edilen peptitler PLGS (Protein Lynx Global Server) kullanılarak UNIPROT veritabanı ile eşleştirilerek kimliklendirilmiş, iki biyolojik tekrarın ikişer teknik tekrarı yapılarak ortak bulunan proteinler BAG-1M etkileşim partnerleri olarak kabul edilmiştir.Sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizleri sonucunda tespit edilen BAG-1M etkileşim partnerlerinin hücre içerisinde dahil oldukları mekanizmalar ve protein-protein etkişim ağları sırası ile KEGG ve STRING internet ağ sunucuları kullanılarak analiz edilmiş, proteinler GO Enrichment analizi kullanılarak moleküler fonksiyonlarına göre karbon metabolizması, hücre iskeleti organizasyonu, stres yanıtı ve endoplazmik retikulumdaki protein işlenmesi olmak üzere dört kategori altında incelenmiştir. BAG-1'in endoplazmik retikulum ilişkili degradasyonda görev alabileceğinin düşünülmesinden dolayı bu çalışmada endoplazmik retikulumda protein işlenmesi kategorisine odaklanılmış, etkileşimlerin kanserli ve epitel meme hücreleri arasındaki farkları incelenmiştir.LC-MS/MS analizleri sonucunda kimliklendirilen proteinlerin doğrulanması amacı ile iki boyutlu jel elektroforezi (2-DE) yöntemi kullanılarak proteinler izoelektrik noktaları ve moleküler ağırlıklarına göre ayrılmış, jelden kesilen protein spotları MALDI-TOF analizleri ile kimliklendirilmiştir. Kütle spektrometresi ve iki boyutlu jel elektroforezi sonuçlarında ortak gelen proteinlerin BAG-1M izoformu ile etkileşimi meme kanseri ve meme epitel hücrelerinden saflaştırılan örneklerin immün blotlama analizleri ile de doğrulanmıştır.BAG-1M izoformunun etkileştiği proteinlerle oluşturduğu komplekslerin görev aldığı hücresel mekanizmaları aydınlatması amacıyla doğal formları korunarak transfekte edilen hücrelerden izole edilen ve saflaştırılan proteinlerin oluşturduğu kompleksler mavi poliakrilamid jel elektroforezi ile moleküler ağırlıklarına göre ayrılmıştır. Her bir kompleksin jelden kesilmesi, peptitlerine parçalanması ve LC-MS/MS peptit haritalaması ile kompleksteki proteinler tespit edilmiştir. Komplekslerin incelenmesi ile tespit edilen proteinlerin proteazom alt birimlerini, ubikuitinasyonda görev alan proteinleri, endoplazmik retikulumda yerleşik olan proteinleri içerdiği görülmüş, bu proteinlerin aynı komplekslerde bulunması da BAG-1M'nin endoplazmik retikulum ilişkili degradasyonda görev alabileceği düşüncesini desteklemiştir.Bu çalışmada yapılmış olan tüm deneysel çalışmalarda elde edilen sonuçlar, ısı şok proteini 90 (HSP-90), ısı şoku proteini 70 ailesi üyesi BiP (HSPA5), protein disülfid izomeraz A3 (PDIA3), geçişli endoplazmik retikulum ATPaz (VCP) ve UV eksizyon tamir proteini RAD23 homoloğu (RAD23B) gibi katlanma/yeniden katlanma mekanizmasında görevli ve ubikuitin ile ilişkili proteazomal bozunmada işlevi olan proteinlerle BAG-1M izoformunun etkileştiğini göstermiştir. Meme kanseri ve memexxvepitel hücrelerinde BAG-1M ile VCP ve BAG-1M ile RAD23B etkileşimlerinin farklılık gösterdiği immün blotlama yöntemi ile gösterilmiştir. BAG-1M izoformunun VCP ve RAD23B ile kurduğu etkileşimin sadece meme kanseri hücrelerinde görülmesi bu etkileşimlerin kanser sürecinde önemli rolü olabileceğini düşündümüştür.Yeni tespit edilen etkileşim partnerlerinin PDB veritabanında bulunan yapıları BAG-1'in BAG domaini ve ubikitin benzeri domaini ile PRIŞM web sunucusu kullanılarak incelenmiş, kurulabilecek olası kompleksler yapıları ve iki protein arasındaki enerji seviyesine göre değerlendirilmiştir. Yapısal analizler, RAD23B, VCP ve PDIA3'ün BAG-1 ile etkileşime geçebileceklerini, ancak HSP-90 ve BiP ile BAG-1 etkileşiminin BAG-1'in her iki domaininden de pek olası bulunmadığını göstermiştir.Mavi-nativ jel elektroforezi ile kimliklendirilen kompleksler incelendiğinde, HSP-70 ile HSP-90 ve BiP'in bilinen etkileşimleri, BAG-1 ile HSP70 etkileşiminin biliniyor olması ve yapısal analizlerde BAG-1M ile HSP-90 ve BAG-1M ile BiP'in etkileşiminin olası bulunmaması, bu iki protein ile BAG-1M'nin birlikteliğine HSP-70 veya başka aracı proteinlerin sebebiyet verebileceğini düşündürmüştür.Bu çalışma ile BAG-1M izoformunun doğrudan (fiziksel) veya dolaylı (fonksiyonel) olarak etkileştiği proteinler kimliklendirilmiştir. BAG-1'in rol aldığı mekanizmalar, bilinen etkileşim partnerleri ve yeni tanımlanan etkileşen proteinler göz önünde bulundurulduğunda, endoplazmik retikulumdaki yerleşik proteinlerle, ubikuitinasyon mekanizmasında görev alan proteinlerle, proteazom alt üniteleri ve şaperonlarla olan etkileşimleri BAG-1M izoformunun endoplazmik retikulum ilişkili degradasyon (ERAD) mekanizmasında fonksiyonu olabileceğini önerisini desteklemektedir.Elde edilen deneysel bulgular ve gerçekleştirilen yapısal analizler ışığında gelecekte yapılacak olan bölgesel yönlendirilmiş mutasyonlar ile tespit edilen protein etkileşimlerinin bozulmasının hücre üzerindeki etkilerinin incelenmesi, degradasyon mekanizmasında hedef alınan substratların fonksiyonel analizler ile tespit edilmesi ve in vitro yüzey analizi çalışmaları ile etkileşimlerin analiz edilmesi gibi daha detaylı çalışmaların meme kanserinde bir biyobelirteç olarak görülen BAG-1'in BAG-1M izoformuna özgü fonksiyonlarının aydınlatılmasına, yeni tespit edilen etkileşimlerin kristal yapı çalışmalarına ve kanser tedavisinde kullanılabilecek küçük molekül sentezlenmesi ile yeni terapötik ajanlar geliştirilmesine katkıda bulunabileceği düşünülmektedir.

BAG-1 (Bcl-2 associated athanogene-1) is an anti-apoptotic protein which is a member of BAG family that has been evolutionary conserved in many organisms. BAG-1 is involved in important mechanisms within the cell, as a multifunctional and an adapter protein. BAG-1 functions on the regulation of transcription, hormone activity, cell proliferation, cell motility, tumorigenesis, apoptosis and various cellular signaling pathways via its interactions with heat shock proteins, E3 ligases, nuclear hormone receptors, Raf-1 serine/threonine kinase family, and Bcl-2. When the functions in the cell are taken into account, BAG-1 allows the cell to survive and is overexpressed in many types of cancer. It is thought that BAG-1 has an important role in the development of breast cancer in particular.There are three major isoforms of BAG-1 originated from alternative translation initiation sites on the same mRNA. Both of the three isoforms contain the BAG domain and ULD (ubiquitin like domain) at the C-terminus regions, the difference between the isoforms arise from the N-terminus sites. BAG-1L is the largest isoform, has the nuclear localization signal at the N-terminus and is found in the nucleus, the smallest isoform is the BAG-1S which is known as the most abundant isoform in cell and localized in the cytoplasm. BAG-1M can be found in both cytoplasm and nucleus with a variety of mediator proteins. It is known that BAG-1 isoforms can be specialized to the tissues and cells they are present in, but there is no detailed information in the literature on isoform-specific studies that lighten the proteins that each isoform interacts with and the mechanisms in which it is involved.In this study, it was aimed to detect the interaction partners of BAG-1M isoform in breast cancer and breast epithelial cells.In order to detect the interaction partners of BAG-1M, the vector plasmid that contains the N-terminus TAP-Tagged sequence of BAG-1M was used transfect cells and then BAG-1M was purified from the total protein isolated from the cells transfected. Proteins interacting with BAG-1M were first identified via LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry) analyses for peptide mapping of the digested purified proteins. For verification of identified proteins, 2-DE performed on purified BAG-1M samples and spots of 2-dimensional gel were analyed on MALDI-TOF. For further confirmation, immunoblotting assays were applied on purified samples to check the existance of identified proteins.Pathway analysis and protein-protein interaction networks of the detected proteins were analyzed using KEGG and STRING web servers. For the classification of the identified proteins, GO Enrichment assays were used.In order to illuminate the cellular mechanisms of the complexes formed by BAG-1M and its interacting proteins, native forms of proteins were purified and complexes werexxiiseparated according to their size by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Each complex was cut from the gel, digested to peptides and analyzed on LC-MS/MS for peptide mapping to detect containing proteins.The results obtained in all experimental studies showed that the interacting proteins of BAG-1M as heat shock protein 90 (HSP-90) , heat shock protein family member BiP (HSPA5), protein disulfide isomerase family member A3 (PDIA3), transitional endoplasmic reticulum ATPase (VCP) and UV excision repair protein RAD23 homolog B (RAD23B) which function in folding/refoldig of proteins and the ubiquitin-related proteasomal degradation.Considering of the mechanisms that BAG-1 is involved, known partners and newly identified interacting proteins suggested that interacting with the proteins localized in endoplasmic reticulum, proteins functions in ubiquitination mechanism, proteasome subunits, and chaperons may be related to role of BAG-1M in endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD).Prediction of interaction surfaces of the identified proteins with the BAG domain and ubiquitin-like domain of BAG-1 were performed using the PRISM web server and evaluated according to the energy level between two proteins. Structural analyses showed that RAD23B, VCP and PDIA3 are capable to interact with BAG-1, while HSP-90 and HSPA5 interactions were not found as have possible physical interactions.This study identified proteins that interacting with BAG-1M isoform in direct or indirect manner. More detailed studies that will be performed in the light of the experimental findings and structural analyses can contribute to the elucidation of isoform-specific functions of BAG-1, which is seen as a biomarker in breast cancer, and to the development of new therapeutic agents.