Moleküler baskılanmış polimer reseptörleri ile kolin tespiti için impedimetrik biyosensör geliştirilmesi

Abstract

Elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) ile elektrot-elektrolit arayüzeyinin ve analizi yapılacak moleküllerin bağlanma kinetiklerinin ölçümü yapılmaktadır. Elektrokimyasal teknikler içinde EIS, moleküler etkileşimlerin elektrokimyasal analizlerinde, sensör ve biyosensör teknolojisinin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. EIS, özellikle afinite temelli biyosensör ve sensör uygulamalarında bağlanma bölgeleri ile sinyal iletim sistemlerinin birbirine bağlanmasında avantaj sağlayan bir yöntemdir. Ayrıca EIS yöntemi; kolay uygulanabilirlik, hassas ölçüm yapabilme kabiliyeti ve düşük maliyeti ile elektroanalitik analizlerde de sıklıkla tercih edilmektedir. EIS yöntemi kullanılarak yapılan analizlerde genellikle ikili ya da üçlü elektrot sistemi kullanılmaktadır. Bu çalışmada, elektrokimyasal analizde, çalışma elektrodu (kalem grafit elektrot (PGE)), yardımcı elektrot (platin tel) ve referans elektrottan (Ag/AgCl) oluşan üçlü elektrot sistemi kullanılmıştır. Çalışma elektrodu olarak kalem grafit elektrot kullanılması, yüksek elektrokimyasal aktivitesi, düşük maliyeti ve tekrar üretilebilir elektrot yüzeylerinin olması, kolay ulaşılabilmesi ve mekanik sertliğinin de iyi olması gibi avantajlarından dolayı diğer elektrotlara üstünlük sağlamaktadır. Bu avantajlar kalem grafit elektrotların birçok elektroanalitik çalışmada kullanımını yaygın hale getirmiştir. Bu çalışmada empedans bazlı ölçümlerin seçiciliğini ve spesifikliğini sağlamak amacıyla kalem grafit elektrodlar ve moleküler baskılama yöntemiyle düşük maliyetli, kolaylıkla kullanılabilen, kolin molekülünün hassas ve seçici olarak belirlenmesine yönelik elektrokimyasal biyosensör geliştirilmiştir. Kalem grafit elektrot üzerine moleküler baskılama yöntemiyle kolin baskılanmış olup, daha sonra kolin molekülleri elektrot yüzeyinden uzaklaştırılarak sadece kolin molekülünün bağlanabileceği kolin tanıma bölgeleri oluşturulmuştur. Yüzeyinde farklı miktarlarda kolin boşluğu olan çalışma elektrotlarının, farklı derişimlerde kolin içeren çözeltilerde dönüşümsel voltametri (CV) ve elektrokimyasal empedans ölçümlerinin (EIS) analizi yapılmış, çözeltinin değişen kolin derişimine karşı verdiği akım, gerilim ve empedans yanıtları incelenmiştir. CV ve EIS, elektrot yüzeyinde meydana gelen değişikliklerin ve etkileşimlerin tespit edilmesinde kullanılan, oldukça hassas ölçüm yöntemleridir. CV yöntemi kullanılarak -500/+500 mV arasında değişen gerilim değerine karşı değişen akım yanıtları incelenirken, EIS yöntemiyle empedansta meydana gelen değişimler incelenmektedir. Bu çalışmada asetik tampon çözeltisi (ABS) içerisinde optimizasyonu yapılan elektrotlar kullanılmıştır. Daha sonra elektrotlar negatif ve pozitif kontrol grubu da dahil olmak üzere toplam altı farklı elektrot grubuna ayrılarak, deneysel elektrodların üzerine dört farklı kolin derişiminde moleküler baskılama yapılmıştır. Elektrotların 5 mM [K3Fe(CN)6]-3/-4 redoks çifti içeren fosfat tampon çözeltisi (PBS) içindeki davranışı CV ve EIS yöntemleriyle altı farklı kolin derişiminde karakterize edilmiştir. PBS çözeltisinde yapılan ölçümlerin sonucunda, kolin derişimindeki artışla birlikte artan miktarda molekül elektrot yüzeyine tutunacağından, empedansta da beklendiği gibi bir artış görülmüştür. Dört farklı derişimde kolin baskılanan elektrotların tayin aralıkları altı farklı derişimde kolin içeren PBS çözeltisinde tespit edilerek yapılan regresyon analizine göre en optimum sonucu veren elektrotlar belirlenerek, bu elektrotların seçicilik ve spesifisitesi incelenmiştir. Elektrotların koline özgünlüğünü tespit etmek amacıyla, yakın yapıdaki TRIS molekülü kullanılarak spesifisite analizi gerçekleştirilmiştir. Altı farklı kolin derişiminde yapılan analizlerdeki derişimlerle aynı derişime sahip TRIS çözeltileri hazırlanarak PBS içinde elektrotların ölçümleri yapılmıştır. Yapılan spesifisite analizi sonucunda, kolin baskılanarak hazırlanan elektrotların koline özgü çalıştığı gösterilmiştir. Elektrotların kan serumunda bulunan kolin miktarının tespitinde kullanılabilirliği standart katma metodu yardımıyla gerçekleştirilmiştir. Bu metotta amaç, örneğe eklenen, sabit hacimde ve derişimi bilinmeyen analite karşı değişen miktarlarda ve derişimi bilinen standardın eklenerek enstrüman yanıtında meydana gelen değişiminin saptanması ve bu değişim baz alınarak analitin derişiminin hesaplanmasıdır. Örneğe, sabit miktarda (0.5 mL) serum eklenmesine karşı değişen miktarda (5, 10, 15 ve 20 mL) ve derişimi bilinen standart eklenerek ve toplam hacim PBS ile 30 mL'ye tamamlanarak analiz yapılmıştır. EIS grafiğinden elde edilen empedans verilerine göre yapılan regresyon analizi ve hesaplamalara göre kandaki kolin miktarının 10.64 ± 0.546 µM olduğu tespit edilmiştir.Bu tez çalışmasının sonucu olarak kan serumunda kolin tespitinde en başarılı yanıtı 2E-1ChMPGE elektrodunun verdiği görülmüştür. 2E-1ChMPGE elektrodunun tayin aralığı 71.6 pM-7.16 µM, tayin sınırı da 71.6 pM olarak tespit edilmiştir.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is used to measure the electrode-electrolyte interface and the binding kinetics of the molecules to be analyzed. In electrochemical techniques, EIS has been widely used in the electrochemical analysis of molecular interactions and in the development of sensor and biosensor technology. EIS is an advantageous method of connecting signal transduction systems with binding sites, especially in affinity-based biosensors and sensor applications. In addition, the EIS method is preferred in electroanalytical analyzes because of its easy applicability, precise measurement capability, and low cost. Analyzes, where the EIS method is utilized are usually carried out in two or three-electrode systems. In this study, in the EIS analysis, a three-electrode system consisting of a working electrode (pencil graphite electrode (PGE)), a counter electrode (platinum wire) and a reference electrode (Ag/AgCl) was used. The pencil graphite electrode as the working electrode is superior to other carbon-based electrodes due to its advantages such as high electrochemical activity, low cost and reproducibility of electrode surfaces, ease of accessibility and good mechanical rigidity. These advantages have made the use of pencil graphite electrodes widespread in many electroanalytical studies. In this study, electrochemical biosensor has been developed with low cost and easily usable for the determination of choline molecule by using pencil graphite electrodes and molecular imprinting (MIP) method in order to provide highly selective and specific impedance-based measurements. Choline was imprinted on the graphite electrode surface by molecular imprinting method. Then these choline molecules as a template molecule were removed from the electrode surface and choline recognition sites were formed which could only bind the choline molecule. Working electrodes with different amounts of choline recognition sites on the surface were analyzed in choline-containing solutions at different choline concentrations. Their current, voltage and impedance responses to the changing choline concentration of the solution were investigated on cyclic voltammetry (CV) and EIS methods. CV and EIS are highly sensitive and accurate methods which are used to detect changes and interactions on the electrode surface. In this study, the changes in impedance are examined by EIS method while changing current responses with varying voltage values between -500/+500 mV are examined by CV method. In this study, electrodes optimized in acetic buffer solution (ABS) were used. The electrodes were then divided into a total of six different electrode groups, including the negative and positive control groups, and molecular imprinting was applied on the experimental electrodes at four different choline concentrations which were named as 2E-1ChMPGE, 5E-1ChMPGE, 10E-1ChMPGE and 20E-1ChMPGE according to imprinted concentrations. The behavior of the electrodes in phosphate buffer solution (PBS) containing 5 mM [K3Fe(CN)6]-3/-4 redox pairs was characterized by CV and EIS methods at six different choline concentrations which were E-11 M, E-10 M, E-9 M, E-8 M, E-7 M and E-6 M. As a result of the measurements made in the PBS solution, an increase in the impedance was observed as expected due to the increasing amount of choline concentration attached to the electrode surface. When the choline sites on the electrode surface also increase with increasing imprinted choline concentration, more choline can be attached to these sites since choline-binding properties are affected. Thus, the diameter of the semicircle of the Nyquist diagram, Rct, increases due to choline adsorption to the electrodes. As a result of regression analysis based on impedance values, 2E-1ChMPGE, 5E-1ChMPGE, 10E-1ChMPGE and 20E-1ChMPGE electrodes success choline detection in the rate of 97.96%, 97.98%, 96.88% and 91.99%, respectively. The detection range (DR) of four different concentrations of choline imprinted electrodes were determined in PBS solution containing six different concentrations of choline. The electrodes giving most optimum results were determined according to the regression analysis, and the selectivity and specificity of these electrodes were examined. In order to determine the specificity of the electrodes to choline, specificity analysis was performed using the TRIS molecule having a similar structure.In order to show that the responses of the electrodes were specific to choline, specificity analysis was performed to investigate the responses to the different molecule. The specificity of choline imprinted pencil graphite electrodes was conducted on TRIS (hydroxymethyl) aminomethane molecule to show that the electrodes made a choline specific detection. For analysis, the PBS solutions of TRIS were prepared. Then, the electrodes were analyzed in PBS containing TRIS solutions as the same concentrations with six different choline concentrations. As a result of the EIS responses, it is seen that impedance and Rct values decrease in the increasing number of moles of TRIS in PBS. This demonstrates that the added TRIS does not bind to the choline sites on the electrode surface and stands in the solution. In this way, the conductivity of the solution increased. It has been found that with increasing solution conductivity, the current flow increases and thus the impedance decreases as expected. In consequence, a successful specificity analysis was performed in 95.21% for 2E-1ChMPGE and 94.54% for 5E-1ChMPGE electrodes. The usability of the electrodes in determining the amount of choline in the blood serum was conducted by using the standard addition method. This method is preferred as the calibration method for the determination of an analyte whose concentration is unknown in complex matrices such as biological liquids, soil samples, etc. The signal obtained from the analyte may be blocked by other components present in the complex matrix and error can occur while the determination of analyte concentration. Standard addition method can overcome this problem to a great extent. The main purpose of this method is to insert analyte and standard to the sample and observe changes in instrument response which is impedance for this thesis. It is assumed that the variety in impedance response between the analyte sample and sample results only from the change in analyte concentration. The standard addition method was performed by adding a constant amount (0.5 mL) of serum versus a varying amount (5, 10, 15 and 20 mL) and the known concentration of the standard. And PBS was added until the total sample volume was 30 mL. The EIS results for the 2E-1ChMPGE and 5E-1ChMPGE electrodes show the correlation between increased choline concentration and impedance which indicate the binding of choline. In accordance with EIS graphs of 2E-1ChMPGE and 5E-1ChMPGE electrodes, it is seen that impedance and Rct values increase regularly. According to the regression analysis and calculations made based on the impedance data obtained from the EIS graph, the amount of choline in the blood was found to be 10.64 ± 0.546 µM. In the standard addition method, the analysis was completed 98,32% success rate for 2E-1ChMPGE and 94,12% success rate for 5E-1ChMPGE electrode.As a result of this study, it was seen that the most successful response in the detection of choline in blood serum was given by 2E-1ChMPGE electrode. The detection range of 2E-1ChMPGE electrode is 71.6 pM-7.16 µM and the limit of detection is 71.6 pM. Besides, the preferred molecular imprinting method for choline detection is superior to many electrochemical studies in the literature as it is particularly easy to apply and economical, and can measure in a short time and at a wide detection limit. The low cost of PGE production, the analysis time is between 4.5-5 minutes and the determination range is wide indicate that the biosensor developed in this study can be used effectively in choline detection.