Identification of bacilysin producer cells during biofilm formation in Bacillus subtilis
- Global styles
- Apa
- Bibtex
- Chicago Fullnote
- Help
Abstract
Gram pozitif bakteriler arasında yer alan Bacillus subtilis çubuksu yapıya sahip, patojen olmayan, mezofilik, özellikle toprak, bitki kökleri veya hayvanların gasterointestinal sistemlerinde yaşayan bir bakteri türüdür. B. subtilis besin kıtlığı veya çevresel stresler gibi ortamından aldığı sinyallere ve büyüme koşullarına göre fizyolojik durumunu değiştirebilen, yüksek adaptasyon kabiliyetine sahip bir bakteridir ve bu değişimler morfolojik ve fenotipik olarak da gözlemlenebilmektedir. Fizyolojik durum değişikliğini tetikleyen sebepler arasında çevredeki besin kaynaklarının ulaşılabilirliği, kullanılabilirliği ve onlara karşı olan rekabet, ortamın pH değeri, sıcaklığı ve oksijen miktarı gösterilebilir. Bu fizyolojik durum değişikliklerine bakterinin verdiği adaptif cevaplar arasında da sporulasyon, kemotaksis, genetik kompetans gelişimi ve antibiyotik üretimi sayılabilir ve tüm bunlar hücre yoğunluğunun algılanmasına bağlı oluşan sinyalizasyon ağı (quorum sensing) tarafından düzenlenmektedir.Eğer logaritmik büyüme evresi sonunda, B. subtilis hücreleri sınırlı besin kaynağı sinyali alırsa, bu durumdan kaçınabilmek için kemotaksis (kimyasala yönelim) ya da hareketlilik (motilite) özelliklerini geliştirmektedir. Bu besinsel kıtlık durağan büyüme evresinde hala devam ediyorsa, B. subtilis çevredeki alternatif gıda kaynaklarını parçalayacak proteazlar gibi ya da ortamda üstünlük elde etmesini sağlayacak antibiyotikler gibi ikincil metabolitler üreterek dış ortama gönderebilmektedir. Daha ileri safhalarda ise, hücreler kompetans geliştirip dışarıdaki DNA parçalarını içine alarak genetik çeşitliliğini arttırmaktadır. Tüm bu adaptif tepkilerin yetersiz kaldığı durumda ise B. subtilis son çare olarak hayati fonksiyonlarını durdurarak spor oluşturmaktadır. Biyofilm, bakteriler tarafından üretilen hücredışı polimerik maddelerle (EPS) çevrili, bakterilerin geri dönüşümsüz olarak bir yüzeye veya birbirlerine yapıştıkları mikrobiyal hücre kümeleri olarak tanımlanmaktadır. Biyofilm besin kıtlığı gibi çevresel değişimlere karşı geliştirilen bir adaptasyon olarak, bakteriler arasındaki iletişime dayanan gen ekspresyonunun düzenlenmesi sonucu oluşur ve topluluk içindeki bakterilere antibiyotiklerden veya dezenfektanlardan korunma gibi çeşitli avantajlar sağlar. B. subtilis NCIB 3610 yaban suşu kompleks, damar benzeri görünüme sahip, kalın biyofilm yapıları oluştururken PY79 gibi evcileştirilmiş laboratuvar suşları belirgin şekilde zayıflatılmış, ince, kırılgan, ayırt edici bir makroskopik yapıya sahip olmayan hücre toplulukları oluşturmaktadır. B. subtilis genomunun tamamı dizilenmiş, iyi bilinen ve patojen olmayan bir model organizma olması sebebiyle biyofilm çalışmalarında tercih edilmektedir. Biyofilm oluşumu, bazı dış sinyallere cevap olarak matris genlerinin ifadesiyle başlar. Başlangıçta, hücreler kısa, hareketli, çubuk şeklindedir ancak biyofilm geliştikçe, hücre dışı bir matris salgılayıp birbirlerine ve yüzeye yapışarak hareketli olmayan uzun hücre zincirlerini oluştururlar. Biyofilm olgunlaşma sürecinde, genetik olarak aynı B. subtilis hücreleri, farklı genleri ifade eder ve popülasyon içinde farklı fonksiyonları yerine getiren hücre tiplerine özelleşirler. Olgun biyofilmler, mekansal olarak organize olmuş çok sayıda ve bir arada var olan hücre tipini içerir. Bunlar uzun zincirler oluşturup birbirlerine ürettikleri hücre dışı matris ile tutunan hareketsiz hücreler, hareketli kısa çubuk şeklindeki hücreler ve sporlanan hücrelerdir. B. subtilis popülasyonunun çeşitli hücre tiplerine farklılaşması, hücre yoğunluğunun algılanmasına bağlı oluşan sinyalizasyon ağı (quorum sensing) ve onu kontrol eden sinyalleşme ağlarındaki heterojenliğin bir araya gelmesiyle artar.Bacillus suşları tarafından üretilen basilisin çeşitli bakterilere ve bazı mantarlara karşı antimikrobiyal etki gösteren, L-alanin ve protein kökenli olmayan L-anticapsin'den oluşan basit yapılı bir dipeptit antibiyotiktir. Basilisinin antimikrobiyal aktivitesi yapısındaki L-anticapsinden kaynaklanmaktadır. Polisistronik bacABCDEF (eski ismiyle ywfBCDEFG) operonunun, monosistronik bacG (ywfH) geni ile birlikte basilisin biyosentezinden sorumlu olduğu bilinmektedir. bacABCDF ve bacG basilisinin L-anticapsin oluşumu ve L-alanin ile ligasyonu gibi üretim aşamalarında görev alırken, bacE antibiyotiğin dışarı sentezlenerek üretici organizmanın korunmasından sorumludur. Basilisin biyosentezi ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComA etkisinde hücre yoğunluğuna bağlı sinyalizasyon ağı tarafından kontrol edilir ve Spo0K (Opp)'ya bağlı bir şekilde gerçekleşir. İkincil metabolit olan antibiyotiklerin, üretici organizmaya kazandırdıkları antimikrobiyal aktivite dışında tür içi yada türler arası iletişimde kullanılan anahtar sinyal molekülü gibi farklı görevleri olup olmadığı hep merak konusu olmakta ve en popüler çalışma konularını oluşturmaktadır. Basilisinin özellikle araştırma grubumuzda yürütülen çalışmalarla B. Subtilis'de çoklu etkiye sahip bir regülatör sinyal peptiti (feromon) olabileceği gösterilmiştir. Bu bulgunun temeli laboratuvar grubumuz tarafından yapılmış olan basilisin üreten B. subtilis PY79 ve onun basilisin üretmeyen mutant türevi ile basilisin üretim besiyeri olan PA ortamında karşılaştırmalı transkriptom analizlerine dayanmaktadır. Bu analizler basilisinin kompetans gelişimi, sporulasyon ve biyofilm oluşumu gibi birçok adaptif cevap oluşumunda düzenleyici etkisi olduğunu işaret etmektedir. Bu çalışmalara ek olarak B. Subtilis NCIB 3610 suşunun normal şartlarda biyofilm oluşturamadığı kompleks bir besi yeri olan Luria Broth (LB) içerisine basilisin ekstraktı eklendiğinde yüzeyde kırılgan yapıda ince bir biyofilm oluşturduğu gözlemlenmiştir. En önemli çalışma ise, srfA operonu tarafından ifade edilen sürfaktin antibiyotiğinin B. Subtilis'de biyofilm oluşumunu tetikleyen bir hücre yoğunluğunun algılanmasına bağlı oluşan sinyalizasyon ağı molekülü olduğunun bulunmasıdır. Biyofilm yapısındaki hücrelerin çoğunluğu ComX üretebilirken, yalnızca küçük bir alt populasyon ComX'e yanıt olarak sürfaktin üretebildiği ve sürfaktin ise başka bir hücre kümesini matriks üretici hücrelere dönüştürdüğü bulunmuştur. Daha önceki çalışmamızda, srfA operonun inaktive edilmesi sonucunda basilisinin biyosentezinin durması ile sonuçlanması, aynı zamanda sürfaktin biyosentezinde olduğu gibi basilisin biyosentezinin de hücre yoğunluğuna bağlı sinyalizasyon ağı molekülü olan ComX tarafından tetiklenmesi, sürfaktin gibi basilisinin de biyofilm oluşumu sürecinde düzenleyici rolü olabileceği ihtimaline işaret etmektedir. Tüm bu bilgilerin ışığında, bu proje kapsamında, basilisinin de sürfaktin gibi hücre yoğunluğuna bağlı sinyalizasyon ağı molekülü olup olmadığı bilgisine ulaşmamızı sağlayacak çalışmaların başlangıç bulgusunu oluşturacak, biyofilm yapısı içerisinde bulunan farklılaşmış hücre toplulukları arasında basilisin biyosentezinin özelleşmiş belirli hücre tipleri tarafından üretilip üretilmediği ihtimalinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla öncelikle basilisin biyosentezinden sorumlu bacABCDEF operonunun promotör bölgesi (Pbac) ve yeşil floresan proteinini (GFP) kodlayan açık okuma bölgesi ile transkripsiyonel bir füzyon oluşturulmuştur. Oluşturulan Pbac Biofilm is defined as clusters of microbial cells that are surrounded by extracellular polymeric substances (EPS), and irreversibly attached on a surface or to each other. Bacillus subtilis NCIB 3610 undomesticated strains form complex, thick biofilms with wrinkled structures. B. subtilis as a model organism is preferred in biofilm studies, because it's a well-known and non-pathogenic organism.Biofilm formation initiates with the expression of matrix genes in response to some external signals. At the beginning, cells are short, motile rods but as the biofilm develops, they form long chains of non-motile cells that adhere to each other and to the surface by secreting an extracellular matrix. During biofilm maturation process, genetically identical Bacillus subtilis cells express different genes and specialized into cell types that carry out different functions within the population. Therefore, mature biofilms contain multiple coexisting cell types which are spatially organized: long chains of nonmotile cells that are held together in bundles which produce an extracellular matrix, small rod shape flagellated motile cells and spores. Differenciation of B. subtilis population into various cell-types enhances by combination of Quorum Sensing (QS) signals and heterogeneity within the QS signaling networks.Bacilysin produced by Bacillus species is one of the simplest peptide antibiotics that composed of an L-alanine residue at the N-terminus and a non-proteinogenic L-anticapsin at the C-terminus. The polycistronic bacABCDEF operon (formerly ywfBCDEFG), the monocistronic bacG (ywfH) gene are responsible for bacilysin biosynthesis. The production of bacilysin is controlled by ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComA mediated by quorum sensing system and also by Spo0K (Opp). The comparative transcriptome analysis of B. Subtilis PY79 and its bacilysin non-producer derivative strain in bacilysin production medium performed by our research group strongly suggested that bacilysin plays important roles in sporulation, biofilm formation, competence development. Under normal condition, NCIB 3610 strain cannot form biofilm in LB medium. But, it was observed that 3610 strain can produce a thin layer biofilm in LB medium upon supplementing with bacilysin. B. subtilis QS molecule ComX and the lipopeptide antibiotic surfactin encoding by srfA operon in B. subtilis were shown to be required for bacilysin biosynthesis by our research group. Recently, surfactin was shown to be another QS molecule triggering a subpopulation of B. subtilis cells to become extracellular matrix producers. Interestingly, ComX QS molecule triggers only a subpopulation of cells to produce surfactin, in turn, surfactin causes another subpopulation of cells to produce an extracellular matrix. All of those findings not only strengthened the regulatory role of bacilysin in the biofilm formation process, but also strongly suggested that bacilysin, like surfactin, could be another QS molecule triggering cells to differentiate into distinct cell-type within a developing biofilm. To obtain initial evidences about this possibility, the present study was designed to elucidate whether bacilysin is produced by subpopulation of cells. For this, a transcriptional fusion with the open reading region encoding the green fluorescent protein (GFP) and the promoter region (Pbac) of the bacABCDEF operon was constructed in 3610 to identify individual cells producing bacilysin in biofilm structure. The resulting recombinant strain, amyE
Collections