An investigation of phase transitions in self-assembled peptide nanotubes using dielectric and infrared spectroscopy

Abstract

Halkalı ve aromatik peptitlerin kendiliğinden–organizasyon süreçlerinin keşfi, biyomimetik fonksiyonel malzemelerin `sondan-başa` mühendisliği ile geri dönüştürebilirliği yüksek elektronik ve ya optik cihazların üretimi konusunda yeni ufuklar açtı. Özellikle, kendiliğinden-organize difenilalanin peptitlerin sulu çözeltilerde ve oda sıcaklığında sentezi ile ortaya çıkan heksagonal nanotüp/mikrotüp (FF NT/MT) sistemleri sergiledikleri yüksek mekanik ve kimyasal kararlılık nedeniyle oldukça merak uyandırdı. Yapılan incelemeler sonucunda, FF NT/MT'ni n oda sıcaklığında elektronik, optik ve pek çok doğrusal-olmayan polarizasyonla ilişkili , ferroelektrik etki gibi, özelliklerinin olduğu ortaya çıktı. Daha önceki çalışmalarda, fonksiyonel özellikleri, bilinen benzer özelliklere sahip katı-hal cisimlerde olduğu gibi merkezcil simetrisi olmayan heksagonal kristal yapıdan kaynaklandığı öne sürüldü. Buna rağmen, yaklaşık 20 yıldır süre gelen araştırmacalar sonucu difenilalanin peptitlerle uygulanabilirliği olan bir teknoloji ortaya konulamamadı. FF NT/MT yapısı doğru bir şekilde ortaya konmadığı ve fonskiyonel özelliklerinin kaynağı doğru bir şekilde anlaşılmadığı sürece diğer denemelerin de başarısızlıkla sonuçlanacağını düşünüyoruz.Difenilalanine peptitlerin birincil yapısı, iki adet hidrofobik phenyl grubunun bir alanin ile birleşmesiyle oluşmaktadır. Bu yapıda iki adet hidrofobik fenil grubunun yanı sıra, negatif yüklü karboksil ve pozitif yüklü amino grubu bulunmaktadır. Bu hidrofilik gruplar, birincil yapıdaki difenilalanin moleküllerinin sulu çözeltiye sokulmasıyla birlikte aralarında hidrojen bağı kurarak `baştan-kuyruğa` zincirlerle dipeptide (FF) altıgen ünitesini oluşturmaktadır. Dahası, bu yapısı FF hexamer yüzey normaline paralel bir şekilde c-ekseni boyunca birleşerek su moleküllerini hidrofilik iç yüzeyde tuzaklamaktadır. Bu şekilde meydana gelen nanotüpün Van-der-Waals çapı 1 nm olarak belirlenmiştir. Yapılan kristalografik çalışmalarda bu yapının P61 heksagonal örgüsü ortaya konmuştur. Oluşan nanotüpler hidrofobik fenil gruplarının (π-π) istiflenmesi ile birbirine bağlanarak boyutları uzunlukları 100 - 500 µm arasında değişen mikrotüpleri meydana getirmektedirler. Mikrotübün merkezinde hidrofobik bir kanal bulunmaktadır. Meydana gelen FF NT/MT sisteminde su molekülleri FF nanotüplerin hidrofilik iç yüzeylerinde periyodik bir şekilde yerleşmiş olan karboxil ve amino gruplarına bağlı bir şekilde tuzaklanmış olarak c-ekseni boyunda dizilmiş bir `su kablosu`nu meydana getirmektedir. Dahası, heksagonal halkarın arasında oluşan görece olarak daha büyük serbest hacimlerde kalmış su ile birlikte su dağılımı birbirinden bağımsız şekilde iki ayrı nanotuzaklanmada yerleşmektedir.Su moleküllerinin yaygın hidrojen bağları ile birbirine bağlanarak tetrahedral su ağı oluşturması, aynı moleküler kütleye sahip diğer moleküllerde rastlanmayan fiziksel özellikler göstermesine yol açmaktadır. Suya ait herkesçe bilinen anomalilerin kaynağında bu yapının yattığı öne sürülmüştür. Hidrojen bağlarının enerjisi kovalent bağ ile Van-der-Waals bağ enerjileri arasında kalarak, su moleküllerinin oda sıcaklığında sıvı halde kalmasını sağlamaktadır. Dahası, düşük sıcaklıklara gidildikçe artan hidrojen bağı düzen parametresi, suya ait termodinamik tepki fonsksiyonlarında görülen anomalilere kaynak olmaktadır. Bahsi geçen, fenomenlerin kaynağına inebilmek amacıyla araştırmacılar yığın suyu 229 K sıcaklığına kadar soğutmayı başardılar. Ancak, ani kristalleşme `İnsansız Bölge` olarak adlandırılan ve homojen çekirdeklenme ile kesin bir şekilde sınırı çizilmiş olan bölgeye giren ölçümlerin yapılmasını imkansız hale getirmektedir.Tuzaklanmış su, kristallenmeyi atlayarak `İnsansız Bölge`ye girebilmek gibi bir özelliğe sahiptir. Bu özelliği kullanarak yapılan çalışmalar, nanogözenekli yapılarda ve ya yoğun çözeltilerde aşırısoğutulmuş suyun incelenmesine olanak sağlayarak oldukça yararlı bilgiler edinilmesini sağlamıştır. Ayrıca, bazı çalışmalar lizin ve ya lizozim gibi proteinlerde tuzaklanmış suyun özellikleri ile proteinlerin dinamik ve titreşimsel özellikleri arasında ilişkilerin bulunduğunu göstermişler. Benzer bulguların ışığında, suyun polipeptit ve protein dinamiğin ana bileşenlerinden biri olduğu iddia edilmektedir.FF NT/MT sistemi bir dipeptit yapısı olduğundan dolayı, sistem içerisinde tuzaklanmış olan suyun difenilalaninin yapısal ve fonksiyonel özelliklerinden sorumlu olduğunu düşünmekteyiz. Bu hipotezi araştırmak adına FF NT/MT geniş sıcaklık aralığında Genişbandt Dieletrik Spektroskopi (GDS) ve Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopi (FDKS) uygulanarak dinamik ve titreşimsel özellikleri incelenmiştir. GDS ölçümleri geniş frekans (10-2 Hz– 109 Hz) aralığında ve 100 K- 450 K sıcaklıkları arasında yapılmıştır. İncelemeler sonucunda, 1nm FF heksamer örgüde kısıtlanmış su moleküllerine ait ardışıklı faz geçişlerini tespit ettik. Bahsedilen heterojen iç hacim, görece hızlı ve görece yavaş dielektrik süreçlerin varlığını ortaya koydu. 195 K sıcaklığında ortaya çıkan faz geçişi, uzun-menzilli tetrahedral su örgüsnün tamamlanarak farklı tuzaklanmalarda su gruplarının birbirine bağlandığını göstermektedir. Ardından 230 K'de gerçekleşen faz geçişi ile hidrojen bağları kırılarak bu örgü sonlanmış ve kısa menzilli yerel düzenler meydana gelmiştir. Yapılan Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DTS), bu gözlemlerle uyumlu olarak 195 K'de ısı akışı sinyalinde değişim ve 230 K'de bir tekillik göstermektedir. Ayrıca 160 K – 230 K aralığında gözlemlenen exothermic süreç hidrojen bağlarının kurulduğu bilgisini doğrulamaktadır. İki farklı tuzaklanma pozisyonunda bulunan su gruplarına ait camsı geçiş sıcaklıkları, 205 K ve 133 K olarak saptanmıştır. Oda sıcaklığında gözlemlenen dielektrik geçirgenlik maksimum değeri, tetrahedral örgüden bağımsız kalmış su moleküllerinin döngüsel dipol katkılarını göstermektedir. Bu son bulgu, FF NT/MT ye ait polarizasyonla ilişkili gözlemlenmiş bulguların su molekülleri ile ilişkili olduğunu göstermektedir.Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopi incelemeleri, (1000 cm-1 – 6000 cm-1 ) aralığında ve 88 K-320 K sıcaklıkları arasında uygulanmıştır. Sonuç olarak üç farklı titreşim bandı bulunmuştur. Bunlar; OH-gerilma bandı (3000 cm-1 – 3500 cm-1), CH-gerilme bandı (2820 cm-1 – 2980 cm-1) ve Amide I/II bandı ile OH-bükülme bandının kombinasyonundan ( 1470 cm-1 – 1700 cm-1) oluşmaktadır. OH-gerilme bandı ikiye ayrılmış şekilde FF NT/MT içerisindeki su konumlarının heterojenliğini göstermektir. OH-gerilme bandına ait Gauss modları 195 K'de pik yapıp 230 K e kadar aynı düzeyde seyretmektedır. 230 K'den yüksek sıcaklıklarda ise soğrulma şiddetleri tükenmiştir. Bu gözlem dielektrik spektroskopi sonuçları ile aynı sonuca işaret etmektedir. CH-gerilme bandı faz geçişlerinde tepki vererek peptit-su ilişkisini ortaya koymuştur. Aynı gözlem Amide I/II ve OH-bükülme bantlarının ortaklaşa dinamiklerinde de görülmektedir.Sonuç olarak, FF NT/MT sisteminde tuzaklanmış su moleküllerinin yapısı ve faz geçişleri ortaya konmuştur. Bu faz geçişleri literatürde bir ilktir. Sonuçlarımız, FF NT/MT fonksiyonel özelliklerinin sistem içerisinde bulundan su molekülleri ile ilişkili olduğunu göstermektedir.

Discovery of self-assembly processes of cyclic and aromatic peptide opened new opportunities for biomimetic functional materials, which can pave the way to bottom-up engineering of environmental friendly electronics or optics. Especially, self-assembly of diphenylalanine peptides in aqueous solutions results in highly organised microtubes consists of hexagonal nanotubes (FF NT/MT) with high structural and chemical stability. Furthermore, diphenylalanine nanotubes are claimed to posses electronic, optical and many non-linear polarisation properties such as ferroelectricity. The origin of its properties are believed to be its lattice structure by many researchers. Despite great effort was made, for twenty years, on FF NT/MT a feasible application is not yet discovered. We believe that any further attempt will be futile, unless the the structure of the peptide nanotubes and the origin of their physical properties are fully understood. In primary structure, diphenylalanine molecules contains of two hydrophobic phenyl rings, one carboxyl group and one protonated amino group. The later two moieties residing on the opposite ends of the molecule, build head-to-tail chains with adjacent FF molecules forming a dipeptide hexamer unit closing around the water molecules trapped inside. This structure expands parallel to the normal of FF hexamer plane and forming the nanotubes with a van-der Waals diameter of 10 Å. Outlying hydrophobic phenyl rings joined together with - interactions completing the microtube structure. Completed peptide backbone has a well-defined hexagonal lattice structure P61. Periodically arranged functional groups provide H-Bond donor and acceptor sites. Together with the water wire stretching along the c-axis of nanotubes, there exists three nanoconfinement regions in FF NT/MT. Relatively larger free volume between the hexagonal rings has to be considered as an additional sites for residing water molecules.Water has extensive hydrogen bonded tetrahedral network, which differentiates itself from simple liquids of similar molecular weigth and structure. Anomalous nature of water known to be an outcome its structure. In search for the origings of observed phenomena, researchers were able to cool water down to 229 K. Nevertheless, for measurements on bulk water it is near impossible to enter the so called 'No man's land', where spontaneous crystalisation is unavoidable.Confined water has special attributes such as the ability to by-pass crystalisation and enter into 'No Man's Land'. Pioneering measurements on confined water in nanoporous materials or solutions provided many fullfiling information. Besides, many authors revealed couplings between dynamical or vibrational properties of hydration water and proteins such as lysine or lyzozyme. In accordance with these later findings, water is accepted as constituent of protein or polypeptide dynamics and structure.Even though FF NT/MT is a system of dipeptide sequences, we assume that it's properties are defined by its inherent, confined water molecules as in proteins. Keeping that in mind, we employed Broadband Dielectric Spectroscopy (BDS) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) in wide temperature ranges to investigate dynamical and vibrational properties of confined water in FF NT/MT. BDS experiments are conducted in wide frequency (10-2 Hz – 109) and temperature (100 K – 450 K) range. We have revealed successive phase transitions of water molecules confined in 1nm hexamer rings and between hexamer rings in FF peptide, former having a slower process. In the vicinity of 195 K, dielectric measurements revealed the onset of long-range tetrahedral hydrogen bond ordering between water molecules in distinct regions. As a result of a structural phase transition at about 230 K, frustration of hydrogen bonds leads to local tetrahedral arrangements. Exothermic trend of DSC curve in temperature range 160 K-230K and the singularity at 230 K, reinforces the claim of ordering dipoles and structural phase transition, respectively. DSC measurements on FF NT/MT confirms the structural phase transition at 230 K, with a singularity in heat flow signal. Two glass transitions at 205K and 133K are found related with water clusters in distinct confinement regions. Dielectric response maximum at room temperature can be understood as increased reorientational contribution of water dipoles due to loss of long-range interactions. This later finding gives a clue about the observed phenomena related with polarization. The vibrational characteristics of both confined water and peptide backbone is revealed in FTIR spectroscopy in MIR region (1000 cm-1 – 6000 cm-1) and in temperature range between 88 K and 320 K. Three specific spectral region is identified; OH-Stretching band (3000 cm-1 – 3500 cm-1), CH-Stretching band (2820 cm-1 – 2980 cm-1) and combination of Amide I/II vibrations with OH-Bending (1470 cm-1 – 1700 cm-1). OH-Stretching is deconvoluted into 6 Gaussian modes related with confined water with a split about 3250 cm-1, indicating strong coupling with peptide backbone. This split disappeared as temperature is approached to phase transition at 195 K, where an abrupt increase in infrared absorbance intensity is observed. The band shape remained the same resembling tetrahedral water network until the second phase transition at about 230 K. Above 230 K, long-range tetrahedral range is lost and intensity of OH-Stretching bonds are frustrated. These phase transitions are in line with the dielectric measurements. Further evidence of peptide-water coupling is obtained in CH-Stretching and Amide I/II region, where band intensities are sensitive to mentioned phase transitions.In conclusion, we have revealed the structure and explicit phase transitions of water confined in self-assembled diphenylalanine nanostructures. The observed phase transitions are first in literure concerning the confined water and FF NT/MT. We claim, depending on our results, that observed functional properties of FF NT/MT are caused by dipole contributions of confined water in the system.