Polifenol oksidaz enziminin posof badele elmasından (Malus domestica L.) saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı kimyasalların ve metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi

Abstract

Posof Badele elmasından (Malus domestica L.) yapılan bu çalışmada polifenol oksidaz (PPO) enzimi aseton çöktürmesi yöntemiyle kısmi olarak saflaştırıldıktan sonra afinite kromatografisiyle saflaştırılıp karakterize edilmiş ve enzimin kinetik özellikleri incelenmiştir. Saf enzim örnekleri SDS-PAGE yapıldığında PPO enzimi tek bir bant şeklinde gözlenmiş, enzimin saflaştırıldığı ispat edilmiştir. L-Tirozin, 4-metilkatekol (4-MK) ve katekol substratlarından faydalanılarak PPO'nun spesifik substratı tespit edilmiştir. PPO'nun 4-MK substratıyla optimum pH'sının 5,5 olduğu saptanmıştır. KM ile Vmax değerleri katekol substratıyla 33,3 mM ve 5,86 EU/mLdk, 4-MK substratıyla ise 8,53 mM ve 3,54 EU/mLdk olarak tespit edilmiştir. Optimum sıcaklık, pH kararlılığı, termal stabilitesi ve inhibisyon çalışmaları için PPO'nun aktivitesi 4-MK substratıyla ölçülmüştür. Enzimin stabil pH'sının 6,0, optimum sıcaklığının ise 10°C olduğu saptanmıştır. PPO'nun termal ısı kararlılığı incelendiğindeyse, 15 dakika arayla toplam 1 saat yapılan inkübasyonların ardından, 0-10-20-30°C sıcaklıklarında kararlı olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca saflaştırılan enzim üzerine bazı metal iyonlarının (Mg2+, Al3+, K+, Cu2+ ve Na+) ve kimyasalların etkileri incelenmiştir. Al3+ ve Cu2+metal iyonlarının enzimi aktive ettikleri tespit edilmiştir. Ki ile I50 değerleri hesaplanmış ve inhibisyon türleri tespit edilmiştir. Posof Badele elması (Malus domestica L.) PPO'su üzerine en kuvvetli inhibisyon etkisinin askorbik asit tarafından yapıldığı bulunmuştur.

In the current study, performed with Posof Badele apple (Malus domestica L.), polyphenol oxidase (PBPPO) enzyme was partially purified by acetone precipitation method, then purified by affinity chromatography and kinetic properties of enzyme were investigated. When SDS-PAGE was done with pure enzyme samples, PPO was seen as a single band and purity of enzyme was proved. Spesific substrat of PPO was determined by using L-Tyrosine, 4-methylcatechol (4-MK) and catechol substrates. The optimum pH of the polyphenol oxidase with 4-MK substrate was found as 5.5. KM and Vmax values for catechol were determined as 33.3 mM and 5.86 EU/mLmin, for 4-MK substrate these values were determined as 8.53 mM and 3.54 EU/mLmin respectively. For optimum temperature, pH stability, thermal stability, and inhibition studies enzyme activities were examined with 4-methyl catechol substrate. Stable pH of the enzyme and optimum temperature were found as 6.0 and 10°C respectively. When thermal stability of PPO was examined, it was found that after incubation for 1 hour at 15 minute intervals, it was stable at 0-10-20-30°C. Besides, effects of some metal ions (Mg2+, Al3+, K+, Cu2+ and Na+) and chemicals on pure enzyme activity were investigated. Al3+ and Cu2+ metal ions were found to activate the enzyme. Ki and I50 values were calculated and inhibition types were determined. It was found that the strongest inhibitory effect on the PPO from Posof Badele apple (Malus domestica L.) was made by ascorbic acid.