İnsan serum paraoksonaz (PON1) enziminin yeni bir yöntemle saflaştırılması ve bazı antibiyotiklerin enzim üzerindeki etkilerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, detoksifikasyon ve antioksidan aktivitesi ile metabolizmada önemli fizyolojik fonksiyona sahip paraoksonaz (PONİ) enzimini saflaştırmak için yeni bir hidrofobik etkileşim kromatografisi jeli sentezlenmiştir. Hidrofobik etkileşim kromatografisi jeli, CNBr ile aktive edilmiş Sepharose-4B'ye uzantı kolu olarak L-tirozin bağlandıktan sonra ligand olarak hidrofobik bir molekül olan 1- naftilaminin L-tirozine kenetlenmesi sonucu sentezlenmiştir. Sentezlenen hidrofobik etkileşim jeli ile uygulanan hidrofobik etkileşim kromatografisi ve amonyum sülfat çöktürmesi yöntemleri kullanılarak insan serumundan PONİ enzimi saflaştırılmıştır. Saflaştırılan PONİ enzimi SDS poliakrilamid jel elektroforezine uygulanarak yaklaşık 43kDa molekül ağırlığına sahip tek bant elde edilmiştir.İnsan serum PONI enziminin paraokson substratına karşı Km ve Vmax değerleri Lineweaver-Burk yöntemi ile sırasıyla 4,16mM ve 227,27 U/ml olarak bulunmuştur. Yaygın olarak kullanılan gentamisin sülfat, sodyum ampisilin, sefazolin sodyum, siprofloksasin, klaritromisin, kloramfenikol, rifamisin SV, klindamisin fosfat antibiyotiklerin saflaştınlmış serum PONİ enzimi üzerindeki in vitro etkisi belirlenmiştir. Söz konusu antibiyotikler rifamisin SV antibiyotiği hariç hepsi in vitro olarak PONİ enzimini inhibe ettiği saptanmıştır. înhibisyon etkisi gösteren antibiyotiklerden, sodyum ampisilin, sefazolin sodyum, kloramfenikol ve klindamisin fosfat kompetitif türü inhibisyon gösterirken; gentamisin sülfat, klaritromisin ve siprofloksasinin nonkompetitif inhibisyon etkisi gösterdiği bulunmuştur. Ayrıca söz konusu antibiyotiklerin fare serum ve karaciğer PONİ enzimi üzerindeki 2, 4 ve 6 saat sonraki in vivo etkisi araştırılmıştır. Antibiyotikler uygulandıktan 2, 4 ve 6 saat sonraki serum ve karaciğer PONİ enzim aktivitesi üzerindeki etkisi ile hiç antibiyotik uygulanmamış kontrol grubunun PONİ enzim aktivitesi arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olup olmadığı tespit edilmiştir. Antibiyotiklerin model olarak seçilen insan karaciğer hücreleri (HepG2) tarafından üretilen PONİ enzim aktivitesi üzerindeki in vitro etkisi belirlenmiştir. Doku kültüründe üretilen hücreler üzerinde antibiyotiklerin tümünün uygulandıktan 2, 4 ve 6 saat sonra doza bağlı olarak inhibisyon etkisi gösterdiği belirlenmiştir. ANAHTAR SÖZCÜKLER: Paraoksonaz (PONİ), Hidrofobik etkileşim kromatografisi, Gentamisin sülfat, Sefazolin sodyum, Sodyum ampisillin, EClaritromisin, Kloramfenikol, Siprofloksasin, Klindamisin fosfat, Rifamisin SV, İnhibisyon. III

In this study, a new gel of hydrophobic interaction chromatography for purification of paraoxonase (PON1), which is of important physiological function in metabolism with detoxification and antioxidant activity. The gel was synthesized with Sepharose-4B-L-tyrosine and 1-napthylamine as a hydrophobic ligand. Sepharose-4B was activated with CNBr and than L-tyrosine was add as a extension arm. Human serum paraoxonase was purified with ammonium sulfate precipitation and synthesized hydrophobic interaction chromatography. On SDS-polyacyrilamide gel electrophoresis, purified human serum paraoxonase to give a single band on SDS-PAGE with about weight of 43kDa. The Km and Vmax values were determined by the method of Lineweaver-Burk plots, using paraoxon as a substrate. The Km and Vmax is 4.16mM and 227.27 U/mL, respectively.The effect of some antibiotics which is commonly used on purified human serum paraoxonase in vitro was determined. The name of antibiotics was gentamycin sulfate, sodium ampicillin, cefazolin sodium, ciprofloxacin, clarithromycin, chloramphenicol, rifamycin SV, clindamycin phosphatet. Except of rifamycin SV, all of them caused an inhibition effect on purified human serum paraoxonase in vitro. In addition, the inhibition of paraoxonase activity by sodium ampicillin, cefazolin sodium, chloramphenicol and clindamicin phosphate has competetive and gentamycin sulfate, clarithromycin and ciprofloxacin has non-competetive type inhibition effect was determined. Furthermore, effects of these antibiotics on mouse serum and liver paraoxonase activity were investigated, after drug administration of 2, 4 and 6 hour. The control group which is any drug administration and experiment group was comparison with a statistical analysis. In addition, effects of these antibiotics on paraoxonase, produced by human hepatoma cell line (HepG2), which is a model of human liver paraoxonase, in vitro. The data indicate that, these antibiotics have inhibition effects which is depend on dose on human hepatoma cell line after drug administration of 2, 4 and 6 hour. KEY WORDS: Paraoxonase (PON1), Hydrophobic interection chromatography, Gentamycin sulfate, Cefazolin sodium, Sodium ampicillin, Clarithromycin, Chloramphenicol, Ciproflokcacin, Clindamicin phosphate, Rifamycin SV, Inhibition