İnsan karbonik anhidraz I (HCA I)geninin klonlanması, E.coli`de ekspresyonu ve Phe91Asn yönlendirilmiş mutageneziyle elde edilen mutant enzimin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması

Abstract

?nsan Karbonik Anhidraz (HCA I) (Karbonat hidroliyaz E.C. 4.2.1.1)8. kromozomun uzun kolunda lokalize olan 30kDa büyüklüğünde bir proteindir.Eritrositlerde, kolon epitelinde, göz lensi ve korneal epitelyumda bulunur. Hücreiçinde çözülebilir formda sitozolde yer alan HCA I eritrositlerde hemoglobindensonra en bol bulunan proteindir.Yüksek göz içi basıncını düsürmek amacıyla glokom hastalığının tedavisindekullanılan sülfonamidlerin HCA II izoenziminin yanında HCA I izoenzimini deönemli ölçüde inhibe ettiği saptanmıstır. Bu nedenle arastırmamızda sülfonamidlerekarsı daha az ilgili mutant HCA I enzimleri elde edilmesi planlanmıstır. Bu amaçlainsan hCA I geni, RT-PCR stratejisi ile HL60 hücre hattından pGEM-T vektörüne vedaha sonra pET21a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı. Phe91 hidrofobik rezidüsüPCR 'a dayalı yönlendirilmis mutagenez stratejisi ile daha hidrofilik olan Asnrezidüsüne dönüstürüldü. Yabani ve mutant HCA I enzimlerinin ekspresyonu E.coli'de gerçeklestirildi. Spesifik Sefaroz-4B-L-Tirozin afinite jeli kullanılaraksaflastırıldı, hidrataz aktiviteleri belirlendi. Glokom tedavisinde sıklıkla kullanılansülfonamid ve asetozolamide karsı inhibisyonu arastırıldı.Yabani tip HCA I enziminin aksine (IC50 = 1.257x10-4M), Phe91Asn mutantı,0.468x10-4M IC50 değeri ile sülfonamide karsı daha yüksek afinite göstermistir.Asetozolamide karsı yabani (IC50 = 1.376x 10-6M) ve mutant (IC50 =1.283x10-6M)HCA I enzimleri arasında önemli bir inhibisyon farkı tespit edilmemistir.ANAHTAR SÖZCÜKLER : Afinite kromatografisi, Ekspresyon, Glokom,?nhibisyon, Karbonik Anhidraz, Klonlama, Yönlendirilmis mutagenez, ,

Human Carbonic Anhydrase (HCA I) (Carbonate hydroliyase E.C. 4.2.1.1) isa protein with 30kDa weight and situated on the long arm of chromosome 8. Itpresents in erythrocytes, colon ephithelium, lens of eye and corneal ephithelium.HCA I is the most abundant protein after hemoglobin in erythrocytes which is foundin cytosol and has soluble form.It?s found that sulfonamides which are used in glaucoma treatment to reduceinner eye pressure in glaucoma, inhibit not only HCA II isoenzyme but also HCA Iremarkably. For this aim, in this study it was planned to obtain mutant HCA Ienzymes which have low affinity to sulfonamides. Therefore hCA I gene has beencloned from HL60 (Human acute myeloid leukemic cell line) by RT-PCR strategyand was cloned into pGEMT and subsequently into pET21a(+) expression vector.Phe91 hydrophobic residue was changed into more hidrophilic Asn residue with PCRbased site directed mutagenesis. The expression of wild type and mutant HCA Ienzymes was performed in E.coli. Wild and mutant HCA I enzymes were purifiedby specific Sepharose 4B-L-Tyrosine affinity gel and hydratase and esteraseactivities measured. Inhibition manner of these enzymes by Sulphonilamide andacetozolamide widely used for the treatment of glaucoma was investigated.Phe91Asn mutant (IC50 =0.468x10-5M) has higher inhibition affinity thanwild type HCA I with IC50 values of IC50 = 1.257x10-5M to sulphonilamide. Itwasn?t defined important inhibition difference of wild type (IC50 = 1.376x 10-6M)and Phe91Asn mutant enzyme (IC50 =1.283x10-6M) to acetozolamide.KEY WORDS: Affinity choromatography, Carbonic anhydrase, Cloning,Expression, Glaucoma, ?nhibition, Site-directed mutagenesis,