Bazı sitokinlerin C/EBPd geninin transkripsiyonel regülasyonu üzerine etkilerinin araştırılması

Abstract

C/EBP'ler (CCAAT/enhancer binding proteins) C-terminus'da tümüyelerinde korunmuş bir bazik lösin fermuar domaini içeren transkripsiyonfaktör ailesidir. Bu domain bir DNA bağlanma ve dimerizasyon motifioluşturmaktadır. Ailenin altı farklı üyesi, C/EBP?, C/EBPß, C/EBP?, C/EBP?,C/EBP?, ve C/EBP? olmak üzere, izole edilmiş ve karekterizasyonuyapılmıştır.C/EBP aile üyelerinden biri olan C/EBP? hemen hemen her dokudaekspre edilmesine rağmen seviyeleri farklılık göstermektedir. Örneğin C/EBP?böbrek ve testislerde fazlaca ekspre olmaktadır. İnsan C/EBP? geniş bir açıkokuma dizisine sahip olan bir eksondan ibarettir. C/EBPd 269 a.a.'ten oluşanbir protein şifrelemektedir. C/EBP? doku veya hücre tipine spesifik tarzdaregüle edilmektedir. C/EBP? interlökin-1 ( IL-1), interlökin-6 (IL-6) vetümör nekrosis faktör-? (TNF-?) gibi inflamasyonel uyarıcılar tarafındanregüle edilmektedir.C/EBP? doku hasarları, enfeksiyon, inflamasyon ve akut faz cevapta,hücre proliferasyonunda, hücrelerde enerji metabolizmasının düzenlenmesindeve meme epitel hücrelerinin apoptosisde önemli rol oynamaktadır. C/EBP?gen haritası 8. (8p11.1-p11.2) kromozomdadır. Ve insan kanserlerinin çoğukromozom 8p'de var olan mutasyonlar sebebiyle olmaktadır. Bu sebepledir kiC/EBP? son çalışmalarda bir tümör baskılayıcı gen olarak tanımlanmıştır.Fakat çok sayıda dokulara spesifik genlerin ekspresyonlarını kontrol edenC/EBP?'nın regülasyonu konusundaki bilgi oldukça sınırlıdır.Bu çalışmada, insan C/EBP? geninin transkripsiyonel regülasyonunuaydınlatmayı amaçladık. Bu amaçla lüsiferaz vektörüne klonlanmış olanC/EBP? promoteri insan hepatoma hücre hattı olan Hep3B hücrelerinekalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi ile aktarıldı. Geçici transfeksiyonuygulaması sonrasında, C/EBP? promoterinin bazal aktivietsi lusiferaz aktivitetayini ile belirlendi. Daha sonra IL-6, TNF-?, TGF-ß, IFN-? ve IL-1 gibibirçok sitokinin C/EBP? promoterinin regülasyonuna olan etkileri saptandı.Genin regülasyonunda etkileri belirlenen sitokinlerin konsantrasyon ve zamanbağlı analizleri yapıldı. Ayrıca C/EBP? nın mRNA seviyesinde ekspresyonanalizleri RT-PCR çalışmaları ile belirlendi.Anahtar kelimeler; C/EBP, C/EBP?, İnflamasyon, Sitokinler, Transkripsiyonfaktörleri

CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBPs) are a family oftranscription factors that all contain a highly conserved, basic leucine zipperdomain at the C-terminus. The domain consists of DNA binding anddimerization motif. The six members of the family have been isolated andcharacterized as C/EBP?, C/EBP?, C/EBP?, C/EBPß, C/EBP?, C/EBP?.As one of the C/EBP family members, C/EBP? are almost ubiquitouslyexpressed in every tissues, but with varying levels. C/EBP? expression ismost abundant in kidney and testis. The human C/EBP? turned out to be oneexongene with a large open reading frame encoding a protein of 269 aminoacid. C/EBP? can also be up-regulated in a tissue or cell type-specific manner.C/EBP?, is well known to regulate or co-regulate a wide range of inflammatorymediators and mechanisms in the periphery, including interleukin-1 (IL-1),interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor-? (TNF-?).C/EBP? also plays a role in acute-phase response in injury, infectionand inflammation, cell proliferation, energy metabolism regulation andmammary epithelial cell apoptosis. The human C/EBP? gene maps onchromosome 8 (8p11.1-p11.2). Alterations in chromosome 8p are common inhuman cancers. Accordingly in recent reports, alterations of C/EBP? identifiedas a tumour supressor gene. However, the knowledge of the regulation ofC/EBP? that control the transcriptional regulation of a number of tissuespecific genes is very limited.In this study, we aimed to elucidate the trancriptional regulation of thehuman C/EBP? gene. In this purpose, C/EBP? promoter in a luciferase vectorwas transfected in to human hepatoma cell line (Hep3B) with calciumphosphate transfection method. Upon the transient transfection, the basalactivity of the C/EBP? promoter was determined by luciferase activity.Afterwords, for the determination of cytokine mediated regulation of theC/EBP? gene, several cytokines, namely IL-6, TNF-alfa, TGF-beta, IFN-gamaand IL-1 were used and the effect of cytokines on the C/EBP? geneinvestigated. For the cytokines which have an effect on C/EBP? gene,concentration, time analysis were completed. Futhermore, the expression levelsof C/EBP? mRNAs were also determined with RT-PCR analysis.Key words; C/EBP, C/EBP?, Cytokines, Inflammation, Transcription Factor.