Melissa officinalis L. subsp. officinalis`ten elde edilen polifenoloksidazın karakterizasyonu ve fenolik madde içeriğinin belirlenmesi

Abstract

Bu çalışmada Melissa officinalis L. subsp. officinalis (Oğul otu)'ten polifenoloksidaz (PFO) amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz yöntemleri ile kısmen saflaştırıldı, karakterize edildi ve fenolik ve protein içeriği belirlendi. Oğul otu PFO'sunun substrat spesifikliği, optimum pH, optimum sıcaklık, ısı inaktivasyonu ve I50 değerleri belirlendi. Oğul otundan elde edilen PFO'nun katekol, 4-metilkatekol ve piragallol substratlarına karşı aktivite gösterdiği fakat L-tirozin ve gallik aside karşı aktivite göstermediği bulundu. Enzimin katalizleme gücünü gösteren Vmax/KM değerlerine göre en iyi substratın katekol olduğu ve bunu 4-metilkatekol ve piragallol substratlarının izlediği belirlendi. Melissa officinalis L. subsp. officinalis'in protein ve fenolik madde içeriği de tespit edilmiştir. Toplam fenolik madde içeriği Folin-Ciocalteu metodu kullanılarak 100 g taze bitki için 280 mg olarak bulunmuştur. Melissa officinalis L. subsp. officinalis'in protein içeriği Bradford metodu kullanılarak 230 ?g/mL olarak tespit edilmiştir. Melissa officinalis L. subsp. officinalis'ten elde edilen PFO enzimi için katekol, 4-metilkatekol ve piragallol substratları kullanıldığında optimum pH'nın sırasıyla 6,5, 4,0 ve 8,5; optimum sıcaklığın ise 40, 50 ve 600C olduğu belirlendi. Termal inaktivasyonda ise katekol, 4-metilkatekol, piragallol substratları kullanıldığında artan inkübasyon süresin ve sıcaklığa paralel olarak PFO aktivitesinin belirgin bir şekilde azaldığı gözlemlendi.Askorbik asit, benzoik asit, glutatyon, sodyum azid, gallik asit ve L-glutamik asit oğul otundan kısmen saflaştırılan PFO'nun inhibisyonu için inhibitörler olarak denenmiştir. Elde edilen deneysel verilere göre gallik asit ve L-glutamik asidin oğul otu PFO'sunu inhibe etmediği gözlemlenmiştir. Belirtilen substratlar kullanılarak her bir inhibitör için inhibisyon türü belirlenmiştir. Deneysel sonuçlara göre en güçlü inhibitörün glutatyon olduğu tespit edilmiştir.ANAHTAR SÖZCÜKLER: Melissa officinalis L. subsp. officinalis / polifenol oksidaz / substrat spesifikliği / pH / sıcaklık / ısı inaktivasyonu / inhibisyon / fenolik içerik.

In this study, polyphenoloxidase from Melissa officinalis L. subsp. officinalis (lemon balm) was partially purified by ammonium sulphate ((NH4)2SO4) and dialysis, respectively, characterized and its phenolic and proteine contents were determined. It was determined the substrate specificity, optimum pH, optimum temperature, heat-inactivation and I50 values of polyphenoloxidase of lemon balm. PPO activity was determined using catechol, 4-methylcatechol, pyrogallol, L-tyrosine and gallic acid as substrates. PPO of lemon balm showed no activity toward the L-tyrosine and gallic acid. According to Vmax/KM values catechol was the best substrat, followed by 4-metylcatechol and pyrogallol. The total phenolic and protein contents of Melissa officinalis L. subsp. officinalis were also determined. The total phenolic content was determined according to the Folin-Ciocalteu method and it was found to be 280 mg/100 g on a fresh weight basis; and protein content according to Bradford method and 230 ?g/mL per 100 g on a fresh weight. The optimum pH values of Melissa officinalis L. subsp. officinalis PPO using catechol, 4-methyl catechol and pyrogallol as substrates were 6,5, 4,0 and 8.5; and the optimum temperature values 40, 50 and 60 0C, respectively. It was observed that the enzyme activity especially decreased with increase in temperature and inactivation time for all substrates.Inhibition of lemon balm PPO was investigated using inhibitors such as ascorbic acid, benzoic acid, glutathione, sodium azide, gallic acid and L-glutamic acid. The presence of gallic acid and L-glutamic acid did not cause the inhibition of lemon balm PPO. It was determined type of inhibition for each inhibitor using sellected substrates. From the results it can be said that the most effective inhibitor was glutathione.KEY WORDS: Melissa officinalis L. subsp. officinalis / polyphenoloxidese/ substrat specificity / pH / temperature / inactivation / inhibition / phenolic content.