Bazı karbonik anhidraz izoenzimlerinin saflaştırılması için yeni bir afinite jelinin sentezi ve uygulanması

Abstract

Afinite kromatografisi, proteinlerin saflaştırılmasında, kullanışlı ve uygun bir tekniktir. Bu teknik ile ligand olarak daha önceden orijinal olarak sentezlenmiş bir CA inhibitörü 4-izosiyonatbenzensülfonamit, çalışmada matriks olarak kullanılan Eupergit C-250L 'ye etilendiamin uzantı koluyla bağlanarak yeni bir afinite jeli sentezlenmiştir.Bu reaksiyonda, matriks ile ligand arasındaki reaksiyon mekanizması için gerekli olan ve sterik etkileşmenin kontrolü amacıyla etilendiamin kullanılmıştır. Eupergit C-250L' nin taşıdığı reaktif oksiran grupları, ligandın matrikse bağlanması için uyumlu şartları sağlamaktadır. Eupergit C-250 L- etilendiamin- 4-izosiyonatbenzenesülfonamit kimyasal yapısına sahip afinite jelinin kullanımıyla BCA (sığır eritrosit CA) ve hCA I ve hCA II (insan eritrosit CA) izoenzimlerinin her ikisi de direkt olarak hemolizattan, saflaştırılmıştır..Afinite kolonundan, saflaştırılmış CA izoenzimlerinin elüsyonu için çeşitli tampon çözeltiler kullanılmış, en uygun elüsyon çözeltilerinin, BCA ve hCA-II izoenzimleri için; 0.1 M NaCH3COO / 0.5 M NaClO4 (pH 5.6) ve hCA-I izoenzimi için; 1 M NaCl / 25 mM Na2HPO4 (pH 6.3) olarak belirlenmiştir. Saflaştırma dereceleri sırasıyla, BCA, hCA I, hCA II için 181 ve 184 kat olarak elde edilmiştir. Bu yeni afinite jelinin en uygun pH, sıcaklık ve iyonik şiddet değerleri her bir CA izoenzimleri için tesbit edilmiştir. hCA-I, hCA-II ve BCA izoenzimlerinin her biri için uygun koşulları; 150C, pH 8.5, ve 0.3 iyonik şiddeti olarak bulunmuştur.Her bir izoenzimin saflaştırılması, SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yardımıyla kontrol edilmiştir.ANAHTAR SÖZCÜKLER: karbonik anhidraz / izoenzim / afinite kromatografi/Eupergit C-250 L

Affinity chromatography is a suitable technique which is easily applicable for the rapid purification of a substance from a complex mixture of proteins, according to this advantage of this technique, this present work describes an original affinity gel synthesis was prepared using Eupergit C 250 L derivatized with 4-isocyanatobenzenesulfonamide, an inhibitor of carbonic anhydrase,which is also originally synthesized as well.In this reaction, ethylendiamin was used as a spacer arm for controlling the steric effects between the matrix and ligand. The reactive oxirane groups that Eupergit C-250 L contains, provide the binding of the ligand to the matrix in mild conditions. Both bovine erythrocyte carbonic anhydrase BCA and human erythrocyte carbonic anhydrase I,II (hCA I and hCA II) isozymes have been purified from the hemolysate, directly by using the affinity gel, which has a chemical structure of Eupergit C-250L-ethylendiamin-4-isocyanatobenzenesulfonamide.Different solution buffers were used for obtaining the purified CA isozymes from the affinity column. And 0.1 M NaCH3COO / 0.5 M NaClO4 (pH 5.6) for BCA and hCA-II isozymes and 1 M NaCl / 25 mM Na2HPO4 (pH 6.3) for hCA-I isozyme were determined as most suitable elution buffers. The greatest purification fold for BCA and hCA I, hCAII have been obtained as 181 and 184 folds, respectively. The optimum pH, temperature and ionic strength values of the new affinity gel have been determined for each isozyme of CA. Maximum binding was achieved at 150C, pH 8,5, and 0.3 ionic strength for both hCA-I, hCA-II and BCA isozymes .The purification of an each isozyme has been controlled by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.KEY WORDS: carbonic anhydrase / isozymes / affinity chromatography / Eupergit C-250 L