Viral tanı kitlerinin geliştirilmesi için moloney murine leukemia virus (MMLV) revers transkriptaz enziminin rekombinant olarak üretilmesi

Abstract

Revers Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) yöntemi ile RNA virüslerinin tanısı erken evrede hızlı ve etkili bir şekilde yapılabilmektedir. Enfeksiyonun erken evrede ve hızlı bir şekilde tanısı salgın riskini azaltmanın yanı sıra tedaviye erken başlanması ve etkili ilaç tedavisini sağlar. Ayrıca RT-PCR yöntemi enfekte kişilerde virüs miktarının belirlenmesi ve kişilerin tedaviye verdikleri yanıtı takip etmede kullanılır. MMLV revers transkriptaz enzimi RT-PCR yöntemi için olmazsa olmaz bir unsurdur. Enzimin sağlık alanında öneminden yola çıkarak, bu çalışmada MMLV revers transkriptaz enziminin rekombinant olarak üretimini hedeflenmiştir. Bu çalışmayla MMLV revers transkriptaz enzimini kodlayan nükleotid dizisi Escherichia coli için kodon optimizasyonu yapılarak pTOLT ve pET22b vektör sistemine klonlanmıştır. Elde edilen rekombinant vektörlerle Origami hücreleri transforme edilmiş ve proteinin ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. Protein afinite kromatografisiyle saflaştırılmış ve saflaştırılan enzimin ticari olarak kullanılan enzime benzer bir revers transkriptaz aktivitesi gösterdiği yapılan aktivite testiyle ortaya koyulmuştur. Ayrıca üretilen MMLV revers transkriptaz enziminin bir RNA virüsü olan deforme kanat virüsü (DWV) tayininde kullanılabilirliği de bu çalışma çerçevesinde gösterilmiştir. Sonuç olarak elde edilen MMLV revers transkriptaz enzimi ticari olarak kullanılabilir niteliktedir ve üretilen bu enzim PCR temelli tanı kiti geliştirmek için uygun özelliklere sahiptir.

Diagnosis of RNA viruses can be performed quickly and effectively at an early stage by Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. The early stage and rapid diagnosis of infection provide early treatment and effective medication as well as reducing risk of outbreaks. RT-PCR technique is also used to the follow-infected individuals in their response to treatment, and measuring the amount of virus. MMLV reverse transcriptase enzyme is an essential element for the RT-PCR method. Based on the importance of the enzyme in the medical field, this study is aimed to product recombinant MMLV reverse transcriptase. In this work MMLV reverse transcriptase enzyme coding DNA fragment that are sequence optimised from rare codons for Escherichia coli organism, cloned to the pTOLT and pET22b expression systems. The Origami cells are transformed with the resulting recombinant vectors and expression of the protein are carried out. The protein is purified by affinity chromatography and, it is revealed that the purified enzyme has similar reverse transcriptase activity when we compare it against commercial enzyme through the activity test. Additionally, it is demonstrated that the produced MMLV reverse transcriptase is used for diagnosis of a deformed wing RNA virus (DWV). As a result, obtained MMLV reverse transcriptase enzyme quality might be used commercially and produced enzyme has suitable properties for the development of PCR based diagnostic assay kits.