Transfection of homopyrimidine third strand binding probes into human cells and their specific binding to chromosomal targets

Abstract

nsan genomundaki belirli bölgelerinde meydana gelen nokta mutasyonlarıntamirini hedef alan reaktif ajanların spesifik mutasyon bölgelerine balanmasındahomopürimidin dizisinin kullanımını ve bu dizilerin insan HeLa ve K562 hücrelerinetransfer edilmesine yönelik metod gelitirilmesi. Orak hücreli anemiye neden olanglobin genindeki nokta mutasyonunun düzeltilmesini amaçlayan metodungelitirlmesine yönelik uzun süreçli çalımanın bir parçasıdır. 20-40 nükleotiduzunluunda ve tek dizin olan deoxyoligonükleotidin plazmid olmadan ve viralvektörsüz olarak hücre içerisine transfer edilmesindeki temel amaç gen mutasyonlarınındüzeltilmesidir. Bu deoxtoligonükleotidi hücre içerisine transfer etmek için toksikolmayan transfer ajanları kullanılmıtır. Bu küçük gene parçalarını hücre içersindegörüntülemek için dizinler FITC ve TMR ile iaretlenmitir.5' uzunda psoralen, 3'ucunda FITC veya TMR taıyan probe dizini hücre içerisine transfer edildi ve çekirdekiçerisine hızlı girii gözlemlendi. 23 saat sonra hücre bölünmesini metafaz aamasındadurdurmak için colchicine eklendi. Hücre içerisine transfer edilen probların kovalentba oluturabilmesi için UVA ııa maruz bırakıldı. Hücrelerin hipotonik solisyon ilepatlasınından sonra kromozomları lam üzene yayıldı ve Konfokal mikroskop ileincelendi. 11. ve 17. krozomların sentromerik bölgelerine, globilin, Her2/nue ve topoII gen bölgelerine spesifik probların kullanılmıtır. Yüksek spesifik özellie sahip buprobların doru gen bölgelerine balandıkları gözlemlenmitir. Buna ek olarak transferkinetii ve transfer oranı FACS ile belirlenöitir.Anahtar Kelimeler: Triple Forming Oligonucleotides, transfection, sickle cell anemia,chromosome, modified oligonucleotides.

To utilize homopyrimidine strands as highly specific third strand binding agentsfor delivery of reactive reagents to modify mutant target residues at unique sites in thehuman genome, we have explored methods for transfecting such short deoxyoligomersinto HeLa and K562 cells, and then demonstrated that those strands do, in fact, bind tothe correct target sequences. This work is part of a long term effort to develop a generalmethod for correcting point mutations responsible for human diseases that is presentlyfocused on the b-globin gene mutation that causes Sickle Cell Anemia. Whiletransfection of linear duplex and plasmid DNA into human cells is a well-establishedprocedure, this is not the case for single deoxyoligonucleotide strands 20-40 residueslong (and without added carrier plasmid or viral vector), as we require for gene mutationcorrection. After exploring a variety of transfection reagents, one was found that iseffective at non-toxic levels. To monitor their entry into cells, the strands were labeledwith the fluors FITC or TMR. Probe strands with 5? psoralen and 3? FITC or TMRvitermini were transfected into cells, and were observed to enter nuclei rapidly. After 23hours, colchicine was added to halt cell progression in metaphase; an hour later the cellsreceived a pulse of UVA light to covalently link the probes wherever they might bebound. After bursting the cells in hypotonic solution, their chromosomes were spread onglass slides and examined by confocal microscopy. Using probes specific to centromericsequences of chromosomes 11 and 17, and probes to the b-globin gene in chr #11 andthe Her2/neu and Topo2 genes, both in chr #17, highly specific probe binding to thecorrect chromosome centromeric and arm regions was observed. In addition,transfection kinetics and efficiency were determined using fluorescence activated cellsorting (FACS).Keywords: Triple Forming Oligonucleotides, transfection, sickle cell anemia,chromosome, modified oligonucleotides